任 杰，張勤玉，趙曉超，孫福山*，任百戰(zhàn)，程 森，趙 鵬，高 遠，肖頭杰，徐世峰

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草生物學與加工重點實驗室，青島 266101；2.陜西富安生物科技有限公司，陜西寶雞 721013；3.湖北中煙工業(yè)有限責任公司，武漢 430040；4.陜西省煙草公司延安市公司，陜西 延安 716000；5.上海煙草集團有限責任公司，上海 200082；6.陜西省煙草公司安康市公司，陜西 安康 725000）

酶促棕色化反應導致烤煙顏色在烘烤過程中由黃色變?yōu)椴煌潭鹊暮稚?，是掛灰、蒸片等雜色形成的重要原因之一，嚴重影響煙葉的商品等級和使用價值。在烤煙烘烤過程中為防止酶促棕色化反應，減少煙葉褐變，人們多通過完善烘烤辦法來實現(xiàn)，但該法復雜、繁瑣、可操作性差。因此許多研究者試圖利用各種抑制劑專一地調(diào)控酶促棕色化反應。已經(jīng)證明胱氨酸[1]、L-半胱氨酸[2]、PVP[3]、硫脲[2-4]、銅試劑（NaDiCa）[4-5]、EDTA[3-5]、鉬[6-7]等均能在一定程度上抑制煙草酶促棕色化反應，但這些抑制劑或成本太高或具有很大毒性[4]，實際應用存在一定局限性。

亞氯酸鈉（sodium chlorite，SC）是一種強氧化劑，以前主要用于食品的殺菌消毒。但是近幾年在食品上的研究發(fā)現(xiàn)，SC除能殺滅食品中的病原微生物外，也能抑制食品中的酶促棕色化反應的發(fā)生，一舉兩得[8-12]。最近研究發(fā)現(xiàn)SC可能是通過抑制 PPO活性而直接抑制酶促棕色化反應或通過氧化分解綠原酸等酶促棕色化反應的底物而減少酚類物質向醌類物質的轉化從而降低酶促棕色化反應的發(fā)生[10]。此外，美國食品及藥品管理局（FDA）已經(jīng)批準在一定濃度范圍內(nèi)在果品和蔬菜上使用亞氯酸鈉。調(diào)控煙葉烘烤過程中酶促棕色化反應的發(fā)生和煙葉表面病原微生物的生長是確保煙葉烤后質量的重要方面，但是有關SC對烤煙酶促棕色化反應的影響在國內(nèi)外均未見報道。本研究旨在探討亞氯酸鈉對鮮煙酶促棕色化反應的影響，以期為合理調(diào)控煙葉酶促棕色化反應提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試烤煙品種為K326。試驗于2011年在陜西省旬陽縣豐家?guī)X標準化烘烤工場進行。

1.2 試驗設計

取最容易發(fā)生棕色化反應的上二棚煙葉，進行下列試驗：

1.2.1 不同濃度SC對鮮煙酶促棕色化反應的影響采收上二棚成熟一致鮮煙20片（16～18葉位，5～6成黃綠），每5片一組，分別用100 mg/L（T1處理）、200 mg/L（T2處理）、300 mg/L （T3處理）SC（均加入黏著劑吐溫-20，終濃度為 0.1%）噴施處理，以噴施清水處理為對照（CK）。按照行標YC/T 311—2009規(guī)定的“暗箱試驗”，每12 h 觀察記載煙葉自然條件下變黃（Y）、變褐（B）成數(shù)。

1.2.2 SC不同處理方式對鮮煙酶促棕色化反應的影響 采收上二棚成熟一致鮮煙10片（16～18葉位，5～6成黃綠），每5片一組，用最佳濃度SC處理，處理方式為噴施（P處理）和浸泡（J處理）。浸泡處理時間為2 min。按照“暗箱試驗”，每24 h觀察記載煙葉自然條件下變黃（Y）、變褐（B）成數(shù)。

1.2.3 SC對不同成熟度鮮煙酶促棕色化反應的影響 采收上二棚5～6成黃綠、7～8成黃綠、9～10成黃綠不同成熟度鮮煙各5片，用最佳濃度SC處理，處理方式為噴施。按照“暗箱試驗”，每24 h觀察記載自然條件下煙葉變褐成數(shù)。

另取成熟一致鮮煙20片，每10片一組，用SC最佳濃度、噴施處理，以清水為對照，按照“暗箱試驗”每天定時取樣，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品測定

1.3.1 樣品PPO活性測定 采用文獻[13]的方法，以每克煙葉樣品每分鐘內(nèi)OD420變化0.01為1個酶活力單位（U）。

1.3.2 變黃指數(shù)、變褐指數(shù) 按文獻[14]的方法，在測定時間內(nèi)，定時的測定次數(shù)（n）、變黃成數(shù)（Y）、變褐成數(shù)（B）以求得變黃指數(shù)（Yellowing Index，YI）和變褐指數(shù)（Browning Index，BI）。YI=∑Y/n，指數(shù)值愈大，變黃愈快。BI=∑B/n，指數(shù)值愈大，變褐愈快。

2 結 果

2.1 SC濃度對鮮煙變黃和變褐速率的影響

由圖1可以看出，在36 h前，煙葉變黃速率不同濃度SC間無顯著差異。36 h后，表現(xiàn)出隨濃度增大煙葉變黃加快的趨勢?？傮w來看，隨著SC濃度的增大，煙葉變黃指數(shù)略微增大（表1）。但是300 mg/L SC處理（T3）24 h后煙葉出現(xiàn)藥害。

從圖1還可看出，SC抑制了酶促棕色化反應的發(fā)生，對照煙葉在采后60 h并未完全變黃（8成黃綠）時即已開始發(fā)生褐變，而100 mg/L SC 處理（T1）煙葉在采后84 h變黃達9成黃時開始褐變，較對照晚24 h。200 mg/L SC處理（T2）在采后96 h煙葉變黃即已達10成黃，而在108 h即煙葉完全變黃12 h之后才開始出現(xiàn)褐變，較對照推遲了48 h。但300 mg/L SC處理煙葉褐變速率與對照卻無顯著差異，這可能與此濃度SC處理煙葉發(fā)生藥害有關。從變褐指數(shù)來看，CK為1.5，而T1和T2處理分別為0.8和0.3，大大低于對照，但隨濃度增大T3處理又上升為1.1（表1），這說明在一定濃度范圍內(nèi)SC能抑制煙葉酶促棕色化反應，但濃度超過一定范圍（＞300 mg/L）煙葉發(fā)生藥害，抑制作用消除。

圖1 不同濃度SC對鮮煙酶促棕色化反應的影響Fig.1 Effects of different concentrations of SC on enzymatic browning reaction of tobacco leaves

表1 不同濃度SC處理煙葉變黃指數(shù)、變褐指數(shù)Table 1 Yellowing Index and Browning Index of tobacco leaves treated with different concentrations of SC

2.2 SC不同處理方式對鮮煙變黃和變褐速率的影響

采用噴施和浸泡兩種方式，200 mg/L SC對煙葉進行處理，每24 h觀察一次。從圖2a可以看出，噴施和浸泡兩種方式處理煙葉變黃速率并無顯著差異，均在采后96 h基本完全變黃。從圖2b可以看出，兩種處理方式對煙葉酶促棕色化反應的影響也無顯著差異，均在采后120 h出現(xiàn)褐變。兩種方式處理煙葉從完全變黃至煙葉開始褐變相差24 h，為煙葉變黃后的定色提供了充足的時間。

圖2 SC不同處理方式對鮮煙變黃（a）和變褐（b）速率的影響Fig.2 Effects of different treatment methods of SC on yellowing (a) and browning (b) rates of tobacco leaves

2.3 SC對不同成熟度鮮煙變褐速率的影響

不同成熟度煙葉多酚氧化酶活性不同，酶促棕色化反應發(fā)生程度差異較大，因此不同成熟度煙葉烤后質量也有很大差別[15]。從圖3可以看出，SC對不同成熟度煙葉酶促棕色化反應的發(fā)生均有一定的抑制效果，但不同成熟度之間差異較大。SC處理M2成熟度煙葉在達到完全變黃之后（72 h）即出現(xiàn)褐變，SC處理M1成熟度煙葉經(jīng)96 h完全變黃，120 h出現(xiàn)褐變，中間相隔24 h。SC處理M3成熟度煙葉經(jīng)48 h完全變黃，96 h出現(xiàn)褐變，中間相隔48 h。SC對不同成熟度鮮煙酶促棕色化反應的抑制效果為M3＞M1＞M2。

2.4 SC對鮮煙PPO活性的影響

從圖4可以看出，SC處理和對照煙葉PPO活性變化表現(xiàn)出相似的變化趨勢，但SC處理煙葉PPO活性均低于同期對照處理煙葉。對照處理煙葉PPO活性采后逐漸升高，在48 h達到一個小高峰，之后輕微下降并維持在同一水平，采后120 h之后則迅速上升，采后144 h達到最大。SC處理煙葉PPO活性采后24 h略有上升，48 h有所下降，之后則緩慢上升，至采后144 h達到最大。

圖3 SC對不同成熟度鮮煙酶促棕色化反應的影響Fig.3 Effects of SC on enzymatic browning reaction of different maturity tobacco leaves

圖4 SC對鮮煙PPO活性變化的影響Fig.4 Effects of SC on PPO activity changes of tobacco leaves

3 討 論

亞氯酸鈉因具有殺菌、抑制酶促棕色化反應雙重功效而成為近年來廣受關注的新一代保鮮劑和殺菌劑，它安全、高效、廣譜、無毒副殘留，可廣泛應用于食品、醫(yī)療、環(huán)境、飲水等領域[8]。在對煙葉酶促棕色化反應抑制方面，SC表現(xiàn)出隨濃度增大而增強的趨勢，但是當SC濃度超過300 mg/L時，抑制作用反而下降。在蘋果鮮切片上也表現(xiàn)出相似的現(xiàn)象，這可能是因為高濃度的SC對組織造成了損害[9]。在煙葉烘烤過程中，當煙葉全部變黃，表明葉內(nèi)物質分解轉化已達適宜程度，應使葉片水分大部分失去，使酶的活動基本停止。如果不能及時定色，則會使煙葉色澤不鮮或局部掛灰。但是從圖1可以看出對照處理煙葉在未完全變黃之前即已經(jīng)開始褐變，并沒有為煙葉及時定色提供時間，而200 mg/L SC處理煙葉在完全變黃后12 h才出現(xiàn)褐變，這12 h為煙葉完全變黃后的及時定色提供了充足的時間，使獲得高質量的烤后煙葉成為可能。

葉片浸泡的抑制效果能在較短的時間內(nèi)即顯現(xiàn)出來，不同時間的抑制劑處理對煙葉中多酚氧化酶的活性影響不大[4]。因此，采后葉片浸泡處理和噴施處理本質上是相同的，所以采后噴施處理和浸泡處理對酶促棕色化反應的抑制效果并無顯著差異。成熟度與煙葉烤后質量關系密切，不同成熟度煙葉烤后質量差異巨大，本研究結果說明SC對采后不同成熟度煙葉處理效果不同，其中以M3成熟度效果最好，M1次之，M2成熟度效果最差，這可能與不同成熟度煙葉采后PPO活性有關，有研究表明上部葉鮮煙PPO活性在達到成熟之前逐漸升高，成熟期達到最高，而在充分成熟后PPO活性又急劇下降[16]。

酶促棕色化反應與PPO活性密切相關，抑制煙葉PPO活性也是調(diào)控酶促棕色化反應的主要措施。而SC也顯著抑制了煙葉PPO活性。在生物組織內(nèi)，PPO活性位點與銅離子結合，在棕色化反應中Cu2+和 Cu+保持動態(tài)平衡[17]，而隨著 Cu2+濃度的增加PPO活性下降[18]，而最近也有研究指出SC可能就是通過將Cu+氧化成Cu2+而調(diào)控PPO活性[10,19]。此外，煙葉中的主要多酚化合物如綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結構中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚 3個不穩(wěn)定部分。在酸性條件下 SC能將綠原酸氧化分解為咖啡酸和奎寧酸，而在偏堿性條件下則SC能將綠原酸氧化為相應的醌，而在SC存在的條件下所形成的醌并不能進一步聚合形成色素，相反，通過一段時間的反應后醌也被氧化降解[10]。因此，SC對酶促棕色化反應的抑制可能是通過直接抑制 PPO活性和氧化降解多酚底物或中間產(chǎn)物醌而進行的。SC對酶促棕色化反應抑制的機理不同于還原劑類、螯合劑類、絡合劑類以及底物競爭性抑制劑。

4 小 結

綜上所述，200 mg/L SC能顯著降低鮮煙PPO活性，抑制鮮煙酶促棕色化反應，特別是對充分成熟的上二棚煙葉效果更為明顯。但本實驗只是通過暗箱試驗就SC對烤煙酶促棕色化反應的抑制效果進行初步研究，有關SC對酶促棕色化反應的抑制機理及其對煙葉烘烤質量的影響有待于進一步研究。

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