高曉明，張澤坤，王衛(wèi)鋒，劉貫山，李鳳霞，崔萌萌，孫玉合*

（1.農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109）

煙株上腋芽的存在，會(huì)消耗大量養(yǎng)分，嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。煙草中，已經(jīng)獲得與腋芽分生組織形成相關(guān)基因NtLS，該基因與擬南芥中控制腋芽分生組織形成的LAS基因高度相似[2]，對(duì)該基因進(jìn)行 RNA干擾研究，所獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株，在腋芽的發(fā)生方面與野生型相比沒(méi)有明顯的區(qū)別[3]。LAS和RAX是兩條相對(duì)獨(dú)立的調(diào)控途徑，但是在功能上可能存在互補(bǔ)[4-5]。擬南芥中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)RAX1、RAX2、RAX3基因，同屬于MYB基因家族。MYB基因家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，現(xiàn)有研究表明，植物MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物器官形成、植物葉片的形態(tài)建成及抗病中起重要作用[6]，其途徑之一包括調(diào)節(jié)腋芽分生組織的形成[7]。擬南芥中，RAX基因控制腋芽分生組織形成的非常早期的一步。RAX突變株沿莖軸側(cè)芽形成有缺陷。RAX基因在功能上的冗余，對(duì)擬南芥次生軸的形成產(chǎn)生微調(diào)。其中，RAX1、RAX3基因在腋芽中心組織表達(dá)量較高[8]。

本研究通過(guò)在GenBank中尋找擬南芥RAX基因相關(guān)序列，通過(guò)同源比對(duì)，采用RACE技術(shù)，克隆獲得普通煙草中與RAX基因高度相似的基因，目的是為研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為通過(guò)分子手段解決煙草腋芽問(wèn)題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為K326。2010年冬，在溫室內(nèi)播種，自然光照條件下生長(zhǎng)至營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和檢測(cè) 取煙草K326幼嫩葉片為材料，Trizol法提取幼嫩葉片的總RNA。1×TBE緩沖液，1%瓊脂糖凝膠，電泳檢測(cè)總RNA。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 以總RNA為模板，按照PrimeScriptTM RT-PCR Kit的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3NtRAX中間片段的獲得 以 NCBI的擬南芥AtRAX2基因的序列（NM_129245.2）為信息探針，在煙草EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastp檢索，獲得若干與之同源性較高的蛋白質(zhì)序列。選取與e值最低的蛋白質(zhì)序列對(duì)應(yīng)的核酸序列（471 bp）為參照，設(shè)計(jì)引物，RAX-1：GAAGACAGAGTCATTTGTAGCC；RAX-2：ATTTGGAGTAGAGGGGAAG，以cDNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)400 bp附近的條帶回收并測(cè)序。

1.2.4NtRAX末端 cDNA第一鏈的合成 3′RACE和5′末端第一鏈cDNA的合成，分別以提取的RNA為模板，按照Invitrogen的Generacer試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.5 3′末端片段的擴(kuò)增 用已經(jīng)獲得并測(cè)序驗(yàn)證的404 bp大小的中間片段為模板鏈，設(shè)計(jì)2條末端擴(kuò)增引物：

3race-GSP1：CCAGTTACCAGGCAGGACAGACAATG；

3race-GSP2：TGAAGGCGGAGGAAAGCCAATGAATG；

按照Generacer試劑盒說(shuō)明書配制PCR擴(kuò)增體系。反應(yīng)程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，66 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃，30 s，65 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃，30 s，64 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃，2min，5 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min，4 ℃，HOLD。

1.2.6 5′末端片段的擴(kuò)增 用已經(jīng)獲得并測(cè)序驗(yàn)證的404 bp大小的中間片段為模板鏈，設(shè)計(jì)2條末端擴(kuò)增引物：

5race-GSP1：TCATTGTCTGTCCTGCCTGGTAACTGG；

5race-GSP2：CCATTTCCATTCATTGGCTTTCCTCCG；

按照Generacer試劑盒說(shuō)明書配制PCR擴(kuò)增體系。反應(yīng)程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，68 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃，30 s，66 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃，30 s，64 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min，4℃，HOLD。

1.2.7 PCR產(chǎn)物的回收、連接及測(cè)序 1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切膠，按照康為世紀(jì)瓊脂糖凝膠產(chǎn)物回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行凝膠回收。將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化TOP10E.coil感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白斑進(jìn)行菌落PCR鑒定后，選擇陽(yáng)性克隆搖菌并測(cè)序。

1.3 序列分析

采用 ContingExpress軟件進(jìn)行序列的拼接組裝；NCBI的ORF finder預(yù)測(cè)開放閱讀框；用NCBI的BLASTn序列比對(duì)工具進(jìn)行同源性比對(duì)；蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量計(jì)算，采用 ExPASy網(wǎng)站的Compute PI/Mw tool；Pfam在線(http://pfam.sanger.ac.uk/)進(jìn)行序列保守功能區(qū)的分析；采用 Clustalx軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；以序列比對(duì)的結(jié)果為基礎(chǔ)，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 NtRAX中間片段的獲得

以cDNA為模板，RAX-1和RAX-2為引物，擴(kuò)增獲得一條 400 bp附近片段。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，共404 bp。

2.2 NtRAX全長(zhǎng)基因的獲得

通過(guò)3′末端擴(kuò)增，獲得了723 bp的3′末端，該末端有24個(gè)堿基的PolyA尾巴，表明獲得了完整的3′端編碼序列。通過(guò)5′末端擴(kuò)增，獲得了407 bp的5′末端，在起始密碼子ATG 42 bp前有一個(gè)終止密碼子TAG，表明獲得了完整的5′端編碼序列。

2.3 NtRAX基因的序列分析

使用contingExpress軟件對(duì)382 bp的5′RACE序列、418 bp的3′RACE序列和404 bp的中間序列進(jìn)行拼接，獲得長(zhǎng)度為1112 bp的全長(zhǎng)基因cDNA序列。該序列全長(zhǎng) 1112 bp，含有 429個(gè)腺嘌呤（38.6%）、179個(gè)胞嘧啶（16.1%）、293個(gè)鳥嘌呤（19.0%）、293個(gè)胸腺嘧啶（26.3%）。

對(duì)該序列進(jìn)行ORF分析，得出該序列5′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度為96 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度為954 bp，3′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度為62 bp，其中編碼區(qū)編碼317個(gè)氨基酸（圖1）。將該基因命名為NtRAX（NCBI登錄號(hào)為JQ228591）。

圖1 NtRAX的cDNA和蛋白質(zhì)全長(zhǎng)序列Fig.1 Full-length sequences of NtRAX cDNA and protein

將獲得的NtRAX基因的 cDNA序列在 NCBI上進(jìn)行 BLAST分析，發(fā)現(xiàn)該序列與已有的番茄cDNA文庫(kù)中的單個(gè)克?。↙EFL1032AE06）部分序列相似性為74%，E值為0.0；與擬南芥RAX2基因的序列（NM_129245）相似性為 80%，E值為9e-86。

用ExPASy網(wǎng)站的Compute PI/Mw tool分析得到NtRAX基因所編碼的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為7.02，分子量為35.42 KDa。在線進(jìn)行保守區(qū)域分析，結(jié)果表明，該蛋白在N端分別含有由52個(gè)和49個(gè)氨基酸組成的兩個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域，并且每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有典型的MYB轉(zhuǎn)錄因子所特有的保守的色氨酸殘基W（圖2），說(shuō)明所克隆的NtRAX基因是MYB基因家族成員。

圖2 NtRAX的保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved domains of NtRAX

采用 Clustalx軟件對(duì)來(lái)自擬南芥的AtRAX1、AtRAX2、AtRAX3，來(lái)自大豆的GmMYB12a、GmMYB12B2、GmMYBJ6、GmMYBJ7、GmMYBZ1、GmMYBZ2，來(lái)自楊樹的PeMYBF1、PeMYBL1進(jìn)行多序列比對(duì)（圖3）。由圖3分析，NtRAX蛋白功能與AtRAX具有較高同源性，推測(cè)NtRAX具有調(diào)節(jié)腋芽分生組織形成功能。采用MEGA5軟件分析繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。由進(jìn)化樹可以看出，NtRAX和GmMYBJ7的進(jìn)化關(guān)系最近，推測(cè)NtRAX是具有轉(zhuǎn)錄激活活性的MYB家族基因。

3 討 論

MYB類轉(zhuǎn)錄因子以保守的MYB結(jié)構(gòu)域?yàn)楣餐卣鳌YB結(jié)構(gòu)域是一段約51～53個(gè)氨基酸的肽段，每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有3個(gè)保守的色氨酸殘基(W)[9]，分別被18～19個(gè)氨基酸殘基隔開，折疊成螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋結(jié)構(gòu)，組成1個(gè)疏水核心。按照含有的MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，MYB轉(zhuǎn)錄因子可分成 R1、R2R3、R1R2R3三個(gè)家族[9]。MYB轉(zhuǎn)錄因子主要參與生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和抗脅迫等方面的調(diào)節(jié)[10]。絕大多數(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物代謝調(diào)控中起轉(zhuǎn)錄激活作用，也有少量起轉(zhuǎn)錄抑制作用[11-13]。

圖3 NtRAX蛋白與其他MYB蛋白多重比對(duì)Fig.3 Multi-alignment of NtRAX and other MYB proteins

圖4 煙草、擬南芥、大豆、楊樹的部分MYB基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 A phylogenetic tree of MYB gene from Nicotiana tabacum, Arabidopsis, Glycine max and Populus euramericana

本研究克隆獲得了NtRAX基因，對(duì)新基因功能的預(yù)測(cè)，主要是通過(guò)同源比對(duì)，利用同源基因的功能來(lái)推測(cè)，得出NtRAX基因是具有轉(zhuǎn)錄激活活性的煙草腋芽分生組織形成的調(diào)控基因。該基因的功能，還應(yīng)在后續(xù)試驗(yàn)中不斷驗(yàn)證。

本試驗(yàn)中煙草品種選擇了作為常規(guī)對(duì)照的品種 K326，所取組織為幼嫩葉片。從研究腋芽基因的角度考慮，有以下想法，可在將來(lái)的試驗(yàn)中進(jìn)一步研究：（1）選擇腋芽多發(fā)的煙草品種。不同品種的煙草有其獨(dú)特的生物學(xué)表現(xiàn)，腋芽多發(fā)品種中相關(guān)基因的存在與表達(dá)情況是否與常規(guī)品種一致。（2）選擇煙草植株不同組織，研究相關(guān)基因在不同組織的表達(dá)情況。（3）對(duì)煙草植株進(jìn)行打頂處理，研究打頂前和打頂后不同組織相關(guān)基因的表達(dá)情況。

4 結(jié) 論

本研究運(yùn)用RACE方法克隆得到了煙草腋芽基因NtRAX，NCBI登錄號(hào)為JQ228591，該基因全長(zhǎng)1112 bp，編碼區(qū)954 bp，編碼317個(gè)氨基酸，同源性分析表明，NtRAX屬于MYB基因家族。MYB家族蛋白是一類轉(zhuǎn)錄因子，因此，NtRAX基因編碼的產(chǎn)物可能通過(guò)與相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合，激活和促進(jìn)腋芽的生長(zhǎng)。NtRAX基因的克隆，為進(jìn)一步研究煙草腋芽，從分子角度對(duì)腋芽的發(fā)生進(jìn)行干擾奠定了基礎(chǔ)。

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