杜文娟，王 冬，秦文星，馮 丹，王雅杰（.解放軍總醫(yī)院藥材處，北京 00853；.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院腫瘤科，上海00433）

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα（topoisomeraseⅡα，TopoⅡα）是包括蒽環(huán)類藥物在內(nèi)的多種抗腫瘤藥物的潛在作用靶點(diǎn)[1]，位于17號(hào)染色體的q12-21，與Her-2基因相鄰。蒽環(huán)類藥物并非對(duì)所有的乳腺癌患者均有療效，即便初始治療有效的患者在多次治療后往往出現(xiàn)耐藥[2]，因此，對(duì)蒽環(huán)類藥物療效的預(yù)測指標(biāo)成為乳腺癌個(gè)體化治療的重要部分。作為蒽環(huán)類藥物潛在的靶點(diǎn)，我們推測TopoⅡα有可能成為含蒽環(huán)類化療的療效預(yù)測指標(biāo)。本文回顧性分析了乳腺癌患者的腫瘤組織中TopoⅡα的表達(dá)狀況，討論了含蒽環(huán)類化療方案對(duì)晚期乳腺癌患者5年總生存率和5年無進(jìn)展生存率的影響，旨在探討乳腺癌組織中TopoⅡα的表達(dá)與乳腺癌患者遠(yuǎn)期療效的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象

選取解放軍總醫(yī)院2000年1月- 2006年1月收治的200例女性晚期乳腺癌患者進(jìn)行回顧性研究。患者年齡19～75歲，中位年齡47歲。患者首次就診時(shí)，腫瘤為局部晚期或者已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無法進(jìn)行根治性手術(shù)切除。所有患者均行腫瘤組織切取活檢并且病理診斷明確，其中，浸潤性導(dǎo)管癌172例，浸潤性小葉癌10例，髓樣癌4例，黏液樣癌8例，復(fù)合癌6例。治療前經(jīng)CT或者M(jìn)RI檢查確認(rèn)有可測量、可評(píng)估的腫瘤病灶?；颊呒韧唇邮芎飙h(huán)類藥物方案治療，未行放療；所采用的化療方案包括：（1）CEF方案（環(huán)磷酰胺，表柔比星，5-Fu）；（2）TAC方案（多西他賽，吡柔比星，環(huán)磷酰胺）；（3）CAF方案（環(huán)磷酰胺，吡柔比星，5-Fu）；（4）AC方案（吡柔比星，環(huán)磷酰胺）；（5）CTF（環(huán)磷酰胺，多西他賽，5-Fu）；（6）CMF方案（環(huán)磷酰胺，氨甲喋呤，5-Fu）。應(yīng)用含蒽環(huán)藥物的化療方案中，表柔比星的劑量為90 mg·m-2，吡柔比星劑量為40～50 mg·m-2。每位患者接受化療至少4～6周期?；颊邞?yīng)用不同化療方案情況見表1，P=0.219。

表 1 不同化療方案中乳腺癌患者的Topo Ⅱα表達(dá)Tab 1 The expression of TopoⅡα in the patients receiving different chemotherapy regimens

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 TopoⅡα一抗采用鼠抗人TopoⅡα單克隆抗體；TopoⅡα二抗采用二步法抗兔/鼠通用型二抗；DAB顯色劑均購自北京中杉生物技術(shù)公司。

1.2.2 免疫組化方法 TopoⅡα表達(dá)采用SP免疫組化染色方法測定，所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片4 μm厚，常規(guī)用3% H2O2溶液作用10 min，微波修復(fù)抗原，依次加入一抗（抗TopoⅡα），二抗（抗TopoⅡα），DAB顯色，蘇木素復(fù)染后封片觀察。以TBS液代替一抗作陰性對(duì)照，用已知扁桃體組織作陽性對(duì)照。

1.3 患者腫瘤標(biāo)本指標(biāo)

依據(jù)患者發(fā)病年齡、原發(fā)腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移數(shù)等情況進(jìn)行分類評(píng)估。其中，組織病理學(xué)分級(jí)法是Nottingham聯(lián)合乳腺癌組織學(xué)分級(jí)法。

1.4 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

TopoⅡα染色主要位于胞核內(nèi)，呈清晰棕黃色或黃色彌漫性分布。由2位以上病理科醫(yī)師在不知患者臨床和病理資料的情況下對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)定，陽性細(xì)胞數(shù)≥20%為陽性，＜ 20%為陰性。

1.5 療效判斷

采用RECIST實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。測量指標(biāo)：最大徑總和變化；完全緩解（CR）：全部病灶消失，至少維持4周，無新病灶出現(xiàn)；部分緩解（PR）：最大徑總和縮小≥30%，至少維持4周；穩(wěn)定（SD）：介于PR和PD之間；進(jìn)展（PD）：增加超過20%，或出現(xiàn)新病灶。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)將完全緩解和部分緩解合并為化療有效，穩(wěn)定和進(jìn)展合并為化療無效。每3個(gè)化療周期進(jìn)行療效評(píng)估，達(dá)到PR和CR者4周時(shí)需要療效確認(rèn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究中涉及數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，以P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存率計(jì)算采用Kaplan-Meier法，兩組比較采用log-rank檢驗(yàn)。

1.7 隨訪資料

對(duì)200例患者進(jìn)行隨訪，最短隨訪60個(gè)月，最長隨訪132個(gè)月，中位隨訪時(shí)間96個(gè)月?？偵娴碾S訪起點(diǎn)為進(jìn)入試驗(yàn)開始、終點(diǎn)為死亡。無進(jìn)展生存的隨訪起點(diǎn)為進(jìn)入試驗(yàn)開始，終點(diǎn)為惡化或死亡。隨訪方式為家訪、電話隨訪、信訪及門診隨訪。200例患者中有179例隨訪資料完整，21例失訪，失訪率為10.5%。隨訪截止時(shí)間為2011年2月1日。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者TopoⅡα表達(dá)情況

200例患者中采用CMF方案40例，CTF方案17例，其余采用含蒽環(huán)類藥物方案143例。經(jīng)過免疫組織化學(xué)法檢測，200例乳腺癌患者中TopoⅡα陽性表達(dá)124例（見圖1），TopoⅡα陰性表達(dá)76例（見圖2）。

圖1 TopoⅡα 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的陽性表達(dá)(SPX200)Fig 1 The positive expression of TopoⅡα in breast infitrating ductal carcinoma (SPX200)

圖2 TopoⅡα 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的陰性表達(dá)(SPX200)Fig 2 The negative expression of TopoⅡα in breast infitrating ductal carcinoma (SPX200)

2.2 TopoⅡα陽性表達(dá)與接受含蒽環(huán)方案化療生存情況相關(guān)性

用Kaplan-Meier法估計(jì)TopoⅡα陽性組患者含有蒽環(huán)方案與不含蒽環(huán)方案的5年總生存率及無進(jìn)展生存率（見圖3、圖4）。兩組比較采用log-rank檢驗(yàn)。經(jīng)log-rank檢驗(yàn)提示：TopoⅡα陽性表達(dá)者接受蒽環(huán)方案治療的總生存及無進(jìn)展生存時(shí)間均長于未接受蒽環(huán)方案治療的患者，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.011及0.002）。

2.3 TopoⅡα陰性表達(dá)與接受蒽環(huán)方案化療生存情況相關(guān)性

用Kaplan-Meier法估計(jì)TopoⅡα陰性組患者含有蒽環(huán)方案與不含蒽環(huán)方案的5年總生存率及無進(jìn)展生存率（見圖5、圖6）。兩組比較采用log-rank檢驗(yàn)。經(jīng)log-rank檢驗(yàn)提示：TopoⅡα陰性表達(dá)者接受蒽環(huán)方案治療的總生存及無進(jìn)展生存時(shí)間與未接受蒽環(huán)方案治療的患者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值分別為0.841及0.897）。

圖3 TopoⅡα陽性組患者用不同化療方案的5年總生存率Fig 3 Overall survival according to different chemotherapy regimens in the patients of TopoⅡα positive expression

圖4 TopoⅡα陽性組患者用不同化療方案的5年無進(jìn)展生存率Fig 4 Progression-free survival according to different chemotherapy regimens in the patients of TopoⅡα positive expression

圖5 TopoⅡα陰性組患者用不同化療方案的5年總生存率Fig 5 Overall survival according to different chemotherapy regimens in the patients of TopoⅡα negative expression

圖6 TopoⅡα陰性組患者用不同化療方案的5年無進(jìn)展生存率Fig 6 Progression-free survival according to different chemotherapy regimens in the patients of TopoⅡα negative expression

3 討論

乳腺癌的化療目前已經(jīng)進(jìn)入了個(gè)體化治療階段，基因檢測在指導(dǎo)化療及預(yù)后中的作用日益明顯[3]。通過基因檢測來指導(dǎo)治療策略，可以有的放矢，減少過度化療及無效治療，增加藥品的經(jīng)濟(jì)學(xué)及社會(huì)效益。給予患者一種潛在的毒性藥物總是要權(quán)衡預(yù)期的療效和副作用，應(yīng)用蒽環(huán)類治療乳腺癌之前選擇可能最大受益的個(gè)體是非常重要的。編碼TopoⅡα的基因是蒽環(huán)類藥物作用的主要靶點(diǎn)。因此，大量研究評(píng)估了TopoⅡα基因擴(kuò)增能否作為預(yù)測乳腺癌對(duì)蒽環(huán)類藥物化療反應(yīng)的標(biāo)志物。

國內(nèi)外近年來的研究表明：TopoⅡα蛋白表達(dá)或基因異常與蒽環(huán)類藥物在新輔助治療、輔助治療及晚期姑息治療的療效預(yù)測有關(guān)[4]。Konecny等[5]報(bào)道高危乳腺癌患者在新輔助治療方案中應(yīng)用蒽環(huán)類藥物，TopoⅡα擴(kuò)增患者獲得更高的病理完全緩解率。在DBCG89D臨床試驗(yàn)中，980位絕經(jīng)前、后的高?；颊唠S機(jī)接受CEF或CMF方案化療，收集其中773位（79%）患者腫瘤組織并用熒光原位雜交（FISH）檢測TopoⅡα基因，25%的患者TopoⅡα基因異常。從無復(fù)發(fā)生存期（RFS）來看，TopoⅡα基因擴(kuò)增的患者較TopoⅡα基因正常者應(yīng)用蒽環(huán)類藥物方案獲得較好的RFS。多變量Cox回歸分析表明基因擴(kuò)增的腫瘤患者用CEF治療使復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低61%。TopoⅡα基因擴(kuò)增的預(yù)測價(jià)值在另一個(gè)TopoⅡα臨床試驗(yàn)BCIRG006中也被評(píng)估。3222位HER-2擴(kuò)增的乳腺癌患者隨機(jī)給予ACT方案（阿霉素、環(huán)磷酰胺和紫杉醇），ACTH方案（阿霉素、環(huán)磷酰胺、紫杉醇和曲妥珠單抗）或TCH方案（多西紫杉醇、卡鉑和曲妥珠單抗）化療。其中一個(gè)亞組（2120位患者）的TopoⅡα基因狀態(tài)用FISH檢測，結(jié)果35%的患者有TopoⅡα基因擴(kuò)增，未用蒽環(huán)類藥物治療的患者（TCH）不論TopoⅡα基因狀態(tài)如何，治療效果類似。然而，應(yīng)用含蒽環(huán)類藥物治療組（ACT和ACTH），TopoⅡα基因擴(kuò)增患者有較長的無病生存期。根據(jù)此研究結(jié)果，我們可以得出結(jié)論：TopoⅡα基因無擴(kuò)增的患者可能是非蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的化療方案的理想對(duì)象，從而可以避免蒽環(huán)類藥物潛在的心臟毒性。對(duì)于TopoⅡ基因缺失，有體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)TopoⅡα基因缺失的MDA-361乳腺癌細(xì)胞系的TopoⅡα蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低55%，對(duì)阿霉素的耐藥性較對(duì)照組增加2.4倍。而在上述DBCG89D臨床試驗(yàn)則觀察到與TopoⅡα擴(kuò)增有類似的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由于TopoⅡα蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)錄及翻譯層面受到諸多調(diào)控，基因的表達(dá)量提高可能不會(huì)顯著改變蛋白的表達(dá)。一些學(xué)者對(duì)TopoⅡα基因狀態(tài)與IHC法檢測TopoⅡα蛋白表達(dá)關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)兩者并無密切聯(lián)系。Sheen-Chen SM等[6]在TopoⅡα基因擴(kuò)增和TopoⅡα蛋白過表達(dá)的相互關(guān)系的研究中，發(fā)現(xiàn)蛋白過表達(dá)不是隨著基因擴(kuò)增而擴(kuò)增的。之前研究多是對(duì)于TopoⅡα基因擴(kuò)增的預(yù)測價(jià)值進(jìn)行研究。在目前臨床實(shí)踐中，相對(duì)于基因檢測，免疫組織化學(xué)檢測蛋白表達(dá)更為普及。因此，本研究對(duì)200例晚期乳腺癌患者一線應(yīng)用含蒽環(huán)類的化療方案，分析TopoⅡα蛋白表達(dá)與患者蒽環(huán)類化療藥遠(yuǎn)期療效相關(guān)性進(jìn)行分析，包括5年總生存率和5年無進(jìn)展生存率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TopoⅡα陽性患者用蒽環(huán)方案治療后5年總生存率和5年無進(jìn)展生存率均高于未用蒽環(huán)方案的患者；TopoⅡα陰性患者用蒽環(huán)方案治療后5年總生存率和5年無進(jìn)展生存率與不用蒽環(huán)類患者差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TopoⅡα的蛋白表達(dá)為乳腺癌的治療提供了一定的依據(jù)，TopoⅡα陽性的患者可以優(yōu)先考慮含蒽環(huán)類的化療方案[7]，以提高患者的生存率，從而提高化療療效。

TopoⅡα基因及蛋白表達(dá)情況的復(fù)雜性給TopoⅡα治療預(yù)測的臨床研究帶來了諸多困難，在解釋各項(xiàng)研究所得出的結(jié)果時(shí)必須十分謹(jǐn)慎。另外，TopoⅡα表達(dá)是否和其他化療藥也有密切關(guān)系，TopoⅡα陽性患者是否對(duì)某些化療藥物耐藥或者無效，TopoⅡα表達(dá)是否對(duì)靶向治療提供一定的指導(dǎo)依據(jù)，仍有待于進(jìn)一步研究。

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