戴 穹，鐘 麗，張 旭，楊志惠△

(瀘州醫(yī)學院1解剖學教研室，2附屬醫(yī)院腫瘤科，3病理學教研室，四川 瀘州 646000)

Toll樣受體(Toll－like receptors，TLRs)是一個介導天然免疫的跨膜信號傳遞受體家族，它通過識別病原相關(guān)的分子模式，激活受體后級聯(lián)反應產(chǎn)生相應的免疫應答[1]。本研究擬探討TLR4 D299G、T399I和A896G基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性，并分析其對結(jié)腸癌組織中細胞因子蛋白表達的作用。

材料和方法

1 研究人群

268例結(jié)直腸癌病人為瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科及胃腸外科2009～2010年收治并經(jīng)病理診斷確診的結(jié)直腸癌初診患者。病理分型均為腺癌。根據(jù)TNM分期標準，Ⅰ、Ⅱ期患者共80例，Ⅲ、Ⅳ期患者共188例。另選擇同一地區(qū)健康體檢者268例為對照組。所有研究對象均為無血緣關(guān)系漢族個體，2組性別、年齡、吸煙狀況等分布均無顯著差異。所有研究對象排除心臟、腎臟、肝臟及其它器官系統(tǒng)疾病。每例采血2 mL，EDTA抗凝，－20℃保存，采用酚－氯仿方法提取DNA。部分患者經(jīng)手術(shù)治療后，10 min內(nèi)采集腫瘤活體組織標本，生理鹽水洗滌后液氮凍存，備用。

2 方法

2.1 基因型檢測 分別擴增包含 TLR4 D299G、T399I和A896G多態(tài)性位點的基因序列。根據(jù)文獻[2－3]設(shè)計引物。PCR反應體系為25 μL，內(nèi)含引物、緩沖液、Taq酶和dNTP等，采用Bio－Rad熱循環(huán)儀。反應條件為95℃預變性4 min，94℃ 45 s、55 s(D299G 和 A896:56 ℃ ;G T399I:58℃)，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。D299G，T399I和A896G擴增產(chǎn)物分別為139 bp、406 bp和102 bp，見圖1。

Figure1.Results of TLR4 D299G，T399I and A896G amplicons by polyacrylamide gel electrophoresis.Lane 1 ～ 4:samples of A896G amplicons;Lane 5～8:samples of D299G amplicons;Lane 9～12:samples of T399I amplicons.圖1 TLR4 D299G、T399I和 A896G擴增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳

D299G、T399I和A896G多態(tài)性位點PCR產(chǎn)物10 μL，分別經(jīng)5 U限制性內(nèi)切酶BsaB I、Hinf I和Nco I消化，37℃，過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，見圖2～4。

Figure2.TLR4 D299G genotyping by polyacrylamide gel electrophoresis.Lane 1:GG;Lane 2，3:DG;Lane 4，5:DD;M:marker.圖2 TLR4 D299G經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分型

Figure3.TLR4 T399I genotyping by polyacrylamide gel electrophoresis.Lane 1，3:TI;Lane 2:II;Lane 4:TT;M:marker.圖3 TLR4 T399I經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分型

Figure4.TLR4 A896G genotyping by polyacrylamide gel electrophoresis.Lane 1:GG;Lane 2，3:AG;Lane 4:AA;M:marker.圖4 TLR4 A896G經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分型

2.2 癌組織細胞因子蛋白濃度檢測 選取55例結(jié)直腸癌新鮮活體組織標本，其中25名患者攜帶TLR4 T399I CT或TT基因型，30名患者攜帶CC基因型，2組性別和年齡無顯著差異。

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)檢測腫瘤活體組織勻漿中白細胞介素1α(interleukin 1α，IL －1α)、白細胞介素8(IL －8)、轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor β ，TGF－ β)和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF－α)的表達。ELISA試劑盒購自Invitrogen，操作按試劑盒說明書進行。每份樣本檢測2次，取均值。

3 統(tǒng)計學處理

采用HWE統(tǒng)計學軟件進行Hardy－Weinberg平衡檢測，采用SPSS 12.0軟件包進行t檢驗、χ2檢驗、非條件logistic回歸模型以及相對危險度近似估計值優(yōu)勢比(odds ratio，OR)估計各研究因素與結(jié)直腸癌發(fā)病風險的關(guān)系。

結(jié) 果

1 TLR4基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌相關(guān)性分析

病例組和對照組D299G、T399I和A896G多態(tài)性基因型分布及與結(jié)直腸癌相關(guān)性分析見表1。病例組和對照組基因型分布均符合 Hardy－Weinberg平衡定律(P＞0.05)。D299G和A896G多態(tài)性基因型及等位基因頻率在病例組和對照組中的分布無顯著差異。T399I CT合并TT基因型顯著增加結(jié)直腸癌的患病風險，而攜帶T399I T等位基因的個體患病風險是C等位基因個體的1.843倍。

2 TLR4基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)分層分析

分層分析結(jié)果顯示，D299G、T399I和A896G多態(tài)性與臨床病理分期、腫瘤分化程度無相關(guān)性，見表2，且TLR基因多態(tài)性與性別、年齡、吸煙狀況等無交互作用。

3 TLR4 T399I多態(tài)性對結(jié)直腸癌組織中細胞因子表達的影響

選取攜帶T399I CT或TT基因型個體新鮮結(jié)直腸癌組織樣本25例，攜帶CC基因型個體組織樣本30例，ELISA檢測組織勻漿中IL－1α、IL－8、TGF－β和TNF－α細胞因子表達。結(jié)果顯示，IL－8和TGF－β在不同個體基因型中的表達無顯著差異，但攜帶T399I CT合并TT基因型個體結(jié)直腸癌組織中IL－1α和TNF－α濃度顯著升高，差異顯著，見表3。

表1 TLR4基因多態(tài)性基因型分布及與結(jié)直腸癌相關(guān)性分析Table1.Frequency distribution of TLR4 polymorphisms between cases and controls and their associations with CRC

討 論

本研究應用 PCR－RFLP技術(shù)探討 TLR4基因 TLR4 D299G，T399I和A896G多態(tài)性與大腸腺癌的關(guān)系，以探索疾病的遺傳易感性及機制。CT合并TT基因型顯著增加結(jié)直腸癌的患病風險，而攜帶T399I T等位基因的個體患病風險是C等位基因個體的1.843倍，并且攜帶T399I CT合并TT基因型個體結(jié)直腸癌組織中IL－1α和TNF－α濃度顯著升高。

有研究顯示，TLR4在正常腸道上皮表達量很低，但在炎癥性腸病患者的腸黏膜上皮卻高表達，并且在結(jié)腸癌組織中的表達顯著高于正常對照組[4]。研究顯示，LPS可激活TLR4信號途徑，誘導IL－6等分泌，使腫瘤細胞對細胞毒性T淋巴細胞的攻擊產(chǎn)生抵抗，另外LPS刺激的腫瘤細胞上清液可抑制T細胞增殖和NK細胞殺傷活性[5－6]，致腫瘤逃避免疫攻擊。雖然大腸癌與細菌感染等環(huán)境因素有關(guān)，但其發(fā)生最終取決于個人對腫瘤的易感性。本研究結(jié)果顯示，攜帶TLR4 T399I T等位基因的個體患大腸癌的風險顯著增加，并且這些個體腫瘤組織中IL－1α和TNF－α表達升高。推測由于個體基因型不同，導致個體對細菌等環(huán)境因素反應性不同，TLR4受體后信號途徑被激活后，調(diào)節(jié)細胞因子的表達，促進結(jié)直腸癌的發(fā)生。

表2 TLR4多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)分層分析Table2.The association of clinicopathological parameters of CRC and TLR4 polymorphisms

表3 TLR4 T399I多態(tài)性不同基因型個體結(jié)直腸癌腫瘤組織勻漿中細胞因子的濃度Table3.Concentratons of the cytokines in biopsies of CRC patients with TLR4 T399I polymorphism(ng/L..n=55)

表3 TLR4 T399I多態(tài)性不同基因型個體結(jié)直腸癌腫瘤組織勻漿中細胞因子的濃度Table3.Concentratons of the cytokines in biopsies of CRC patients with TLR4 T399I polymorphism(ng/L..n=55)

＊＊P ＜0.05 vs CC genotype.

Genotype IL－1α TNF－α IL－8 TGF－β CT+TT 34.52±8.97* 40.32±8.95*88.16±4.63 38.57 ±7.75 CC 20.93±6.22 24.30±5.87 85.37±8.74 41.25 ±8.02

[1]Santini D，Angeletti S，Ruzzo A，et al.Toll－like receptor 4 Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms in gastric cancer of intestinal and diffuse histotypes[J].Clin Exp Immunol，2008，154(3):360 －364.

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