李銀珍，王 芳，邵 瓊，張 旭，鄧 玲，湯 濤，張 曉，吳秋良

(華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)腫瘤防治中心 1分子診斷科，2病理科，廣東 廣州 510060)

免疫球蛋白重鏈(immunoglobulin heavy chain，IgH)基因單克隆重排是B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤(B－cell non－Hodgkin lymphoma，B－NHL)的重要特征，國(guó)內(nèi)外病理界已達(dá)成一致共識(shí):應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)檢測(cè)IgH基因單克隆重排可以輔助診斷BNHL[1－3]。由于IgH基因單克隆重排過(guò)程的復(fù)雜性、多樣性和引物設(shè)計(jì)的局限性，IgH基因單克隆重排的檢測(cè)方法目前并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，假陰性率和假陽(yáng)性率較高，使其應(yīng)用受到限制[2]。2008年起，本課題組不斷優(yōu)化引物選擇、改進(jìn)檢測(cè)體系，最終建立了成熟的IgH基因單克隆重排檢測(cè)方法，與臨床病理診斷取得了高度的一致性與吻合率。本文將介紹優(yōu)化的IgH基因單克隆重排檢測(cè)方法，并且比較IgH基因單克隆重排檢出率在B－NHL和T細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤(T－cell non－Hodgkin lymphoma，T－NHL)、淋巴結(jié)反應(yīng)性增生中的差異，為IgH基因單克隆重排檢測(cè)用于B－NHL輔助診斷提供依據(jù)。

材料和方法

1 標(biāo)本來(lái)源

198例石蠟標(biāo)本均來(lái)自中山大學(xué)腫瘤防治中心病理科2009年～2011年間診斷為淋巴瘤的存檔蠟塊及外院送檢石蠟標(biāo)本，男性134例，女性64例。標(biāo)本分為B－NHL組121例、T－NHL組58例和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組19例。陽(yáng)性對(duì)照為證實(shí)發(fā)生IgH基因單克隆重排的B－NHL病例，陰性對(duì)照為淋巴結(jié)慢性炎，空白對(duì)照為雙蒸水。所有病例均由兩位高年資病理醫(yī)生重新閱片并按照2008年WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷和分類。

2 DNA提取

用無(wú)菌刀片切取石蠟標(biāo)本3～4片，厚度為4～5 μm，裱于非涂膠白片。常規(guī)脫蠟后，對(duì)照HE刮取腫瘤組織，避開(kāi)壞死、出血組織。按照QIAamp? DNA FFPE Tissue Kit說(shuō)明書(shū)提取DNA，－20℃保存。

3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA的濃度與純度，并稀釋至50～70 mg/L，看家基因β－actin擴(kuò)增，證實(shí)DNA的質(zhì)量。

4 引物設(shè)計(jì)

IgH基因單克隆重排檢測(cè)所使用上游引物針對(duì)骨架區(qū)(framework region，F(xiàn)R)2和FR3設(shè)計(jì)，下游引物針對(duì)重鏈連接區(qū)(joining region of heavy chain，JH)設(shè)計(jì)，命名為 LJH和VLJH，見(jiàn)圖1。引物 FR2、FR3、LJH、VLJH 以及內(nèi)參照引物 β－actin均由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列見(jiàn)表1，稀釋至10 μmol/L，－20 ℃保存。

Figure1.The primers of monoclonal IgH gene rearrangement.圖1 IgH基因單克隆重排引物設(shè)計(jì)

表1 引物序列Table1.The sequences of the primers

5 PCR擴(kuò)增

PCR體系均為25 μL，反應(yīng)液為2×Pfu PCR Master Mix。IgH基因單克隆重排檢測(cè)采用半巢式PCR法，A管+B管模式，A管上游引物為FR2，B管上游引物為FR3，第1輪PCR下游引物為L(zhǎng)JH，第2輪PCR下游引物為VLJH，所有標(biāo)本進(jìn)行復(fù)孔。PCR程序?yàn)?95℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)(半巢式PCR第1輪為16個(gè)循環(huán))，最后72℃ 7 min。

6 PCR產(chǎn)物分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖(含0.5 mg/L EB替代液)電泳，電壓220 V，25 min，凝膠成像系統(tǒng)照相分析。

7 盲法設(shè)計(jì)

采用Excel表中的Random函數(shù)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行隨機(jī)排列，以排除結(jié)果判讀時(shí)的主觀傾向。

8 IgH基因單克隆重排判斷標(biāo)準(zhǔn)

電泳后，見(jiàn)1～2條清晰條帶，邊緣整齊，寬＜l mm，其中IgH基因單克隆重排A管條帶250～270 bp，B管條帶80～120 bp，且復(fù)孔結(jié)果一致，視為IgH基因單克隆重排陽(yáng)性;背景上條帶彌散、呈涂抹狀或無(wú)條帶存在，或復(fù)孔結(jié)果不一致，視為陰性，見(jiàn)圖2。

Figure2.Result of clonal IgH gene rearrangements.Marker:50 bp DNA ladder;PC:positive control;NC:negative control;BC:blank control;S1:sample 1，positive;S2:sample 2，positive;S3:sample 3，negative.圖2 IgH基因單克隆重排判斷標(biāo)準(zhǔn)

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DNA質(zhì)量檢測(cè)

經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀與β－actin擴(kuò)增檢測(cè)，121例BNHL中，3例沒(méi)有DNA，58例T－NHL中，4例沒(méi)有DNA。其余 DNA濃度在76.5～359.1 mg/L之間，A260/280值在1.9～2.0之間，β－actin擴(kuò)增在268 bp處均有明亮單一的條帶，見(jiàn)圖3。

Figure3.PCR result of β －actin.M:50 bp DNA ladder;S1 ～S10:sample 1～10.圖3 β－actin擴(kuò)增結(jié)果

2 IgH基因單克隆重排檢出率的組間差異

118例B－NHL中，96例檢測(cè)到IgH基因單克隆重排，檢出率為81%(96/118);54例T－NHL中，2例檢測(cè)到IgH基因單克隆重排，檢出率為4%(2/54)，19例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生中，未檢測(cè)到IgH基因單克隆重排，見(jiàn)表2。B－NHL組與T－NHL組、淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組相比，IgH基因單克隆重排檢出率差異顯著(P 值分別為1.35×10－21和6.63 ×10－13)。

表2 IgH基因單克隆重排的組間差異Table2.B－NHL identified by the use of monoclonal IgH gene rearrangements

3 IgH基因單克隆重排檢出率的基因差異

118例B－NHL中，F(xiàn)R2基因單克隆重排檢出68例，檢出率為57.62%(68/118)，F(xiàn)R3基因單克隆重排檢出65例，檢出率為55.08%(65/118)，聯(lián)合應(yīng)用FR2和FR3，IgH基因單克隆重排檢出96例，檢出率為81.36%(96/118)，見(jiàn)表3。FR2與FR3之間檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，聯(lián)合應(yīng)用FR2和FR3與單獨(dú)應(yīng)用FR2、FR3的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值分別為7.54×10－5和1.47×10－5)。

4 B－NHL各亞類檢測(cè)結(jié)果

118例B－NHL中，IgH基因單克隆重排檢出率從高到低依次為:套細(xì)胞性淋巴瘤95%(18/19)＞伯基特淋巴瘤89%(8/9)＞小B細(xì)胞性淋巴瘤86%(6/7)＞邊緣區(qū)淋巴瘤83%(24/29)＞濾泡性淋巴瘤82%(23/28)＞彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤65%(17/26)，見(jiàn)表3。

表3 IgH基因單克隆重排在不同類型B－NHL中的差異Table3.The types of B－NHL identified by the use of monoclonal IgH gene rearrangements

討 論

在B淋巴細(xì)胞分化成熟過(guò)程中，免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)基因的V、D、J片段要發(fā)生分子重排，從而成為具有表達(dá)功能的基因。當(dāng)某一B淋巴細(xì)胞克隆性增生(如BNHL)時(shí)，這些相同的Ig基因重排構(gòu)型經(jīng)PCR擴(kuò)增后，電泳呈一窄帶，稱為單克隆;不同來(lái)源的淋巴細(xì)胞其重排的堿基序列各異，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，電泳呈彌散分布或涂抹狀，稱為多克隆。因此檢測(cè)標(biāo)本是否發(fā)生Ig基因單克隆重排可輔助診斷 B － NHL[2－3]。

2002年 BIOMED－2協(xié)作研究計(jì)劃完成，該研究報(bào)道[2，7－8]，采用新鮮標(biāo)本或冰凍組織，28 條引物、8 個(gè)反應(yīng)管同時(shí)檢測(cè)免疫球蛋白重鏈(heavy chain，H)、κ鏈、輕鏈(light chain，L)，B細(xì)胞淋巴瘤中Ig基因單克隆重排的檢出率可達(dá)90%以上。臨床實(shí)際工作中，送檢的均為石蠟包埋組織，新鮮標(biāo)本難以得到，且28條引物、8個(gè)反應(yīng)管同時(shí)檢測(cè)繁瑣、費(fèi)時(shí)，不利于臨床上普及應(yīng)用，因此我們綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[1，9]，結(jié)合臨床實(shí)際，反復(fù)實(shí)踐，將Ig基因單克隆重排的檢測(cè)方案做了如下優(yōu)化:以重排檢出率最高的IgH為檢測(cè)對(duì)象，采用FR2、FR3、LJH、VLJH 引物組合、A管 +B管模式、半巢式PCR法。本研究利用該實(shí)驗(yàn)方案對(duì)118例B－NHL石蠟組織進(jìn)行IgH基因單克隆重排檢測(cè)，檢出率為81%，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的70% －90%的檢出率一致[4－7]。54例T－NHL中，2例檢測(cè)到IgH基因單克隆重排陽(yáng)性，檢出率為4%(2/54)，19例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生病例均未檢出IgH基因單克隆重排。B－NHL組與T－NHL組、淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組相比，IgH基因單克隆重排檢出率差異顯著，因此可用該實(shí)驗(yàn)方案檢測(cè)IgH基因單克隆重排輔助臨床B－NHL的診斷。

研究顯示，F(xiàn)R2與FR3之間檢出率(58%與55%)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合應(yīng)用FR2和FR3(檢出率為81%)與單獨(dú)應(yīng)用FR2、FR3的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見(jiàn)，聯(lián)合應(yīng)用FR2和FR3可顯著提高IgH基因單克隆重排檢測(cè)率。

本研究118例B－NHL，涵蓋了臨床診斷中6種最常見(jiàn)的B－NHL類型，其檢出率由高到低依次為:套細(xì)胞性淋巴瘤95%(18/19)＞伯基特淋巴瘤89%(8/9)＞小B細(xì)胞性淋巴瘤86%(6/7)＞邊緣區(qū)淋巴瘤83%(24/29)＞濾泡性淋巴瘤82%(23/28)＞彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤65%(17/26)，與BIOMED－2計(jì)劃、國(guó)內(nèi)李新霞等的報(bào)道一致[7－9]。本研究顯示，IgH基因單克隆重排在套細(xì)胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和小B細(xì)胞性淋巴瘤中檢出率高達(dá)85%以上，推測(cè)可能是因?yàn)樘准?xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和小B細(xì)胞性淋巴瘤的腫瘤細(xì)胞主要來(lái)源于生發(fā)中心前B細(xì)胞，較少發(fā)生體細(xì)胞突變，因此檢出率較高。對(duì)于邊緣區(qū)淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤和彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤等成熟型的淋巴瘤，由于發(fā)生體細(xì)胞超突變，導(dǎo)致VH基因片段缺失，因此陽(yáng)性率稍低[9]。由此可見(jiàn)，IgH基因單克隆重排的結(jié)果對(duì)套細(xì)胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和小B細(xì)胞性淋巴瘤的診斷具有明確的指導(dǎo)意義。

54例T－NHL中，2例檢測(cè)到IgH基因單克隆重排陽(yáng)性，其中1例為血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤，1例為外周T細(xì)胞性淋巴瘤，檢出率為4%(2/54)。我們對(duì)這2例T細(xì)胞性淋巴瘤病例另外進(jìn)行了TCRγ基因單克隆重排的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其TCRγ基因單克隆重排也為陽(yáng)性，即為文獻(xiàn)報(bào)道的“雙重排陽(yáng)性”[10]，其檢出率為5% ～29%。

PCR技術(shù)應(yīng)用于石蠟組織IgH基因單克隆重排檢測(cè)以來(lái)，一直飽受假陽(yáng)性和假陰性的困擾，其原因主要有以下幾點(diǎn):(1)石蠟標(biāo)本固定不規(guī)范;(2)組織在甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋過(guò)程中，DNA的完整性受到破壞;(3)切片厚度＞5 μm，切片數(shù)量過(guò)多等導(dǎo)致脫蠟不干凈、消化不徹底，影響DNA的質(zhì)量;(4)壞死、出血組織過(guò)多抑制PCR反應(yīng);(5)反應(yīng)性增生淋巴細(xì)胞比例過(guò)大，惡性單克隆細(xì)胞不能成為優(yōu)勢(shì)，單克隆條帶淹沒(méi)在彌散或涂抹狀電泳中;(6)模板DNA的量過(guò)多或過(guò)少均會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性和假陰性的存在;(7)引物覆蓋率不高;(8)檢測(cè)方法敏感性低。

為提高IgH基因單克隆重排的檢出率，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，我們做了以下改進(jìn):(1)組織用10%中性福爾馬林固定8 ～10 h;(2)組織“求精不貪多”，厚度4～5 μm，手術(shù)標(biāo)本2～3張切片即可，活檢穿刺標(biāo)本10～12張切片裱在2張HE玻片上;(3)對(duì)照HE染色刮片，只刮取腫瘤組織;(4)使用專業(yè)的石蠟組織DNA提取試劑盒;(5)檢測(cè)DNA的濃度與純度，將DNA稀釋至50～70 mg/L濃度范圍;(6)使用看家基因β－actin擴(kuò)增，證實(shí)DNA的質(zhì)量;(7)采用更為敏感的半巢式PCR法，提高檢出率;(8)每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照;(9)由PCR經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)以上改進(jìn)，198例標(biāo)本中，共有7例無(wú)DNA，排除了假陰性的可能，其余標(biāo)本DNA質(zhì)量均較高，單克隆重排重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵守盲法原則，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

總之，采用 FR2、FR3、LJH及 VLJH引物組合、A管 +B管模式和半巢式PCR法進(jìn)行IgH基因單克隆重排檢測(cè)，簡(jiǎn)單易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，陽(yáng)性率較高，可用于臨床B－NHL與T－NHL、淋巴結(jié)反應(yīng)性增生等的鑒別，尤其是當(dāng)組織形態(tài)不典型、免疫組化效果欠佳時(shí)，單克隆重排檢測(cè)的結(jié)果對(duì)B－NHL的診斷顯得尤為重要。

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