何小杰 李延輝 徐 飛 袁煜宗 (東莞市石碣醫(yī)院眼科，廣東 東莞 523290)

老年性白內(nèi)障的發(fā)病率不斷上升，已成為目前世界上第一位致盲眼病〔1〕。雖然手術(shù)一直是治愈老年性白內(nèi)障，讓患者重見光明的主要手段，但手術(shù)畢竟用人工材料置換替代本身晶體的組織器官，從某種意義上是有所缺陷的;同時(shí)其手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及昂貴的手術(shù)設(shè)備、耗材等經(jīng)濟(jì)原因也讓許多較貧困老年性白內(nèi)障患者望而卻步。因此，深入研究白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制，通過預(yù)防白內(nèi)障發(fā)生或延緩其發(fā)展的途徑來征服老年性白內(nèi)障已成為一項(xiàng)十分有益的課題。研究表明，細(xì)胞凋亡在白內(nèi)障的發(fā)病中起著重要的作用，且晶狀體上皮細(xì)胞(LECs)的凋亡是除先天性白內(nèi)障以外的所有類型白內(nèi)障形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)〔2〕。caspase-3是近年來發(fā)現(xiàn)執(zhí)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，一些研究資料顯示，caspase-3可能參與了LECs的凋亡和白內(nèi)障的形成〔3，4〕。本研究通過研究老年性白內(nèi)障患者及正常人LECs的凋亡情況及相關(guān)調(diào)控基因caspase-3的表達(dá)，進(jìn)一步闡明LECs凋亡在老年性白內(nèi)障患者發(fā)生過程中的分子生物學(xué)機(jī)制，為白內(nèi)障的治療以及藥物的開發(fā)提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2007年9月至2012年2月我院眼科收治的老年性白內(nèi)障患者25例為研究組，其中男13例(13眼)，女12例(12眼)，年齡50～79歲，平均年齡(62.4±4.6)歲。所有病例均在常規(guī)白內(nèi)障顯微手術(shù)術(shù)中采用連續(xù)環(huán)形撕囊，獲取其中央部的晶狀體前囊膜(直徑約5 mm)。另收集無白內(nèi)障發(fā)生的成年人尸體解剖眼球的晶狀體前囊膜標(biāo)本10例(標(biāo)本來自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院)為對照組。兩組取材標(biāo)本均置入10%中性緩沖甲醛溶液中固定24～48 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約 3 μm。

1.2 主要試劑 EnVision試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，caspase-3山羊抗人多克隆抗體(工作濃度1∶50)均購自美國PTG公司。TUNEL檢測細(xì)胞凋亡試劑盒購自Roche公司。

1.3 TUNEL方法檢測LECs的凋亡 切片常規(guī)脫蠟、水化、3%H2O2滅活處理、蛋白酶K消化，PBS液洗滌3次后加入TUNEL反應(yīng)液(含TdT和Bio-21-dUTP)，置37℃水浴箱1 h;終止后加入SAAP反應(yīng)液，置37℃水浴箱30 min;用DAB顯色，蘇木素襯染，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。用無DNA末端轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)記液代替TUNEL反應(yīng)液設(shè)為陰性對照。結(jié)果判定:細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，而正常細(xì)胞核被染為藍(lán)色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率:凋亡細(xì)胞與總細(xì)胞的比值即為上皮細(xì)胞凋亡率。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組化Envision法檢測兩組LECs中caspase-3的表達(dá)。操作程序:切片常規(guī)脫蠟和水化后，置于3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，微波加熱修復(fù)抗原，10%正常血清封閉，滴加一抗(caspase-3)，4℃冰箱孵育過夜，滴加二抗-HRP多聚體，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素襯染，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。PBS代替一抗為陰性對照，試劑盒提供的樣本片為陽性對照。染色結(jié)果判斷:LECs內(nèi)見黃色或棕色顆粒為染色陽性。每張切片隨機(jī)選擇檢查5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。0%～5%為(－);5% ～10%為(+);20% ～35%為();35% ～50%為()。(+)～()記為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)法和等級相關(guān)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組LECs的凋亡情況比較 研究組LECs中可見胞核呈棕黃色顆粒的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞百分率為(30.4±3.7)%。對照組LECs中偶見凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞百分率為(0.27±0.12)%，研究組顯著高于對照組(t=11.59，P＜0.01)。

2.2 兩組LECs中caspase-3蛋白的表達(dá)比較 研究組LECs中caspase-3蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于對照組(t=12.05，P＜0.01)，表1。

表1 兩組LECs中caspase-3蛋白的表達(dá)比較

2.3 caspase-3表達(dá)與細(xì)胞凋亡數(shù)之間的關(guān)系 25例老年性白內(nèi)障患者的LECs中caspase-3蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡數(shù)間呈正相關(guān)(r=0.621，P ＜0.01)。

3 討論

晶狀體的發(fā)展依賴LECs不斷增殖和分化，LECs作為晶狀體中唯一有分裂活性的細(xì)胞，對晶狀體纖維生長和生長質(zhì)量、維持晶狀體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、保持晶狀體纖維滲透壓的穩(wěn)定起著重要的作用。目前研究認(rèn)為白內(nèi)障的發(fā)生與LECs的凋亡有直接關(guān)系，凋亡可導(dǎo)致LECs的結(jié)構(gòu)和功能受損，并隨之發(fā)生細(xì)胞骨架和晶狀體蛋白變性、大分子聚集等一系列生化改變，形成白內(nèi)障〔5，6〕。但近年來的研究對老年白內(nèi)障LECs是否存在細(xì)胞凋亡一直未有定論，對其具體分子生物學(xué)機(jī)制也尚不清楚。

Li等〔7〕用透射電鏡觀察正常及白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn):正常LECs形態(tài)規(guī)則，一般無凋亡發(fā)生，而白內(nèi)障患者LECs中可見凋亡細(xì)胞。TUNEL法是經(jīng)過不斷改進(jìn)而發(fā)展起來的一種有效檢測細(xì)胞凋亡的技術(shù)，該方法有特異性，且在光鏡下可辨認(rèn)單個(gè)散在分布的凋亡細(xì)胞。本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了LECs凋亡與老年性白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)。因此，綜合利用基因工程，免疫組化，免疫印跡等先進(jìn)研究技術(shù)深入研究影響LECs凋亡的相關(guān)調(diào)節(jié)基因的作用及其機(jī)制，就可能抓住老年性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)節(jié)，為其防治提供新的思路。

caspase是一組半胱氨酸蛋白酶家族，是近年來細(xì)胞凋亡分子生物學(xué)研究的重要發(fā)現(xiàn)。caspase-3是該家族中執(zhí)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，細(xì)胞經(jīng)氧化劑、紫外線等誘因刺激之后，caspase-3從線粒體釋放并被激活，可使細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞骨架的重要蛋白質(zhì)降解失活，從而發(fā)生細(xì)胞凋亡〔8〕。本研究結(jié)果與王凱軍等〔9〕和鄭廣瑛等〔10〕研究結(jié)果相似，提示caspase-3可能在老年性白內(nèi)障形成過程中起重要作用。推測可能與caspase-3蛋白能參與酶切多種底物有關(guān)，其中晶狀體連接蛋白是其直接作用目標(biāo)。LECs凋亡或其他損害，可使晶狀體內(nèi)外鈣離子失衡，可激活caspase-3蛋白酶系統(tǒng)，從而致細(xì)胞骨架及晶體連接蛋白降解，最后導(dǎo)致晶狀體蛋白聚集，伴隨出現(xiàn)的水電平衡失調(diào)及其他一些病理改變，最終形成白內(nèi)障。

綜上所述，LECs凋亡及caspase-3表達(dá)在老年性白內(nèi)障的形成過程中起重要作用，相信隨著LECs凋亡及caspase-3表達(dá)調(diào)控機(jī)制逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，caspase-3上游基因和下游的作用底物及各種協(xié)作因子將被逐漸闡明，caspase-3表達(dá)抑制劑的研發(fā)，利用其減緩老年性白內(nèi)障的形成及發(fā)展，可能會(huì)成為今后研究的新方向。

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