張寶友，李春英，趙春建

(東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱150040)

山竹 (Garcinia mangostana L.)又稱山竹子、莽吉柿、鳳果和倒捻子素，是藤黃科 (Guttiferae)藤黃屬 (Garcinia)常綠喬山竹的果實。原產(chǎn)于印度尼西亞和馬來西亞，是一種典型的熱帶水果，主要分布于泰國、越南、馬來西亞、印度尼西亞和菲律賓等東南亞國家，我國臺灣、福建、廣東和云南也有引種［1］。山竹果皮一直作為泰國傳統(tǒng)醫(yī)藥用于腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創(chuàng)傷、慢性潰瘍、白帶、淋病、白血病、乳腺癌、肝癌等疾病治療［2-6］。近年來，山竹，特別是山竹果皮的化學成分及其生物學活性成為人們的研究熱點［7-9］。本文旨在探討山竹提取物的抗氧化活性，為山竹果皮的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山竹 (Garcinia mangostana)購自哈爾濱市水果市場，去除果肉，果皮氣干后，用小型粉碎機粉碎后進行提取。

Folin-Ciocalteu試劑、DPPH、兒茶素、氮藍四唑、黃嘌呤氧化酶購自Sigma公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外-可見分光光度計，日本島津公司;R-1001-V/VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;TSHZ-2A臺式水浴恒溫振蕩器，上海躍進醫(yī)療器械廠;HYQ-2121A渦旋混勻器，南京暢翔儀器設(shè)備有限責任公司;PT1200型手持式組織均質(zhì)機，上海易擴儀器有限公司;Stat Fax 2100酶標儀，美國Awareness公司。

1.3 山竹果皮有效成分的提取

山竹果皮粉用70%乙醇冷浸提取3次，每次2天，萃取液過濾，一部分濾液50℃下減壓濃縮至原體積的1/5，得濃縮液，備用;另一部分濾液50℃下減壓濃縮至干。

1.4 山竹果皮提取物分段萃取

山竹果皮乙醇提取物濃縮液依次以二氯甲烷、正丁醇進行液液萃取，將山竹果皮乙醇提取物初步分為二氯甲烷可溶部分、正丁醇可溶部分和水可溶部分3個分離部分，每一分離部分分別濃縮至干，并稱重。

1.5 總酚含量測定及統(tǒng)計分析

總酚含量按照Folin-Ciocalteu法測定［10］，并適當修改:以兒茶素為對照品進行檢測。試驗時，取500μL Folin-Ciocalteu試劑 (1 N)加入500 μL不同濃度兒茶素于離心管中，渦旋混勻30 s，并靜置5 min后，添加1 mL 20%Na2CO3再靜置10 min。然后離心，取上清液，于730 nm測定吸光值，并根據(jù)此吸光值與兒茶素濃度繪制標準曲線。樣品分析，以1 mg·mL-1樣品取代兒茶素，其余操作同上。將樣品吸光值代入上述標準曲線即可算出每克提取物中所含兒茶素相對量，并以此表示山竹果皮的總酚含量。本試驗為3次重復。

利用SAS系統(tǒng)中Scheffe統(tǒng)計方法，檢驗山竹果皮各可溶部分的總酚含量是否具顯著差異，分析時所使用的置信區(qū)間為95%。

1.6 抗氧化活性試驗

1.6.1 DPPH 自由基清除效應

方法［11］，并做適當調(diào)整:取1000μL DPPH乙醇溶液 (0.1 mmol·L-1)、450μL Tris-HCl緩沖液 (50 mmol·L-1，pH 7.4)與50 μL 不同濃度的試驗樣品或者維生素C溶液，渦旋混勻后避光靜置30 min，于517 nm下測定吸光值。以同體積乙醇代替樣品同法操作，為對照。本試驗為3次重復。根據(jù)吸光值計算DPPH自由基清除率。

式中:Aa為試驗組吸光值;AC為對照組吸光值。

1.6.2 超氧自由基作用試驗

參考文獻方法［12］，并略有改動:取 20μL 15mmol· L-1Na2EDTA(用 50 mmol· L-1KH2PO4/KOH 緩沖液配制)、50 μL 0.6 mmol·L-1氮藍四唑 (以50 mmol·L-1KH2PO4/KOH緩沖液配制)、30 μL 3 mmol·L-1肌苷 (以50 mmol·L-1KOH配制)、5μL不同濃度的試驗樣品以及145μL緩沖液 (50 mmol·L-1KH2PO4/KOH，pH 7.4)于96孔板中均勻混合。再迅速添加50μL黃嘌呤氧化酶 (0.1 U·mL-1)，反應過后，利用酶標儀測定570 nm下吸光值，每20 s測量一次，并持續(xù)測量5 min。以同體積的乙醇作為對照，計算對照組與試驗組其反應速率，并按照下式計算試驗樣品的超氧自由基清除率 (%)。本試驗為3次重復。

式中:Ka為試驗組反應速率;KC為對照組反應速率。

1.6.3 β-胡蘿卜素漂白法測定抗氧化能力

取10mL 0.01mg·mL-1β-胡蘿卜素氯仿溶液加入20 mg亞油酸和100 mg吐溫40，置于旋轉(zhuǎn)瓶于50℃蒸出氯仿。加入50 mL含氧蒸餾水，超聲成乳狀液。取200μL不同濃度的樣品或兒茶素乙醇液與5 mL乳狀液混合，以等量乙醇代替樣品與乳狀液混合作為空白樣。50℃保溫2 h，于470nm下測定吸光度。本試驗為3次重復。用下式計算抗氧化率。

式中:A1為t=2 h時樣品的吸度度;AC1為t=2 h時空白樣的吸光度值，AC0為t=0時空白樣的吸光度值。

1.6.4 還原力的測定

參考文獻方法［13］:先將500μL不同濃度的試驗樣品、500μL 0.2M 磷酸緩沖液 (pH 6.6)與500μL1% 鐵氰化鉀混合，50℃保溫20 min，然后加入500μL 10%三氯乙酸，離心 (3000 rpm，10 min)，取500μL上清液，再添加500μL去離子水及100μL 0.1%FeCl3，混勻，靜置10 min后測定700 nm下的吸光值。吸光值越高代表其還原能力越強。本試驗為3次重復。

1.6.5 抗脂質(zhì)過氧化試驗

從雞蛋中分離出蛋黃，并用組織勻漿機攪拌呈漿狀，此勻漿物作為脂質(zhì)試驗材料。分析時，于勻漿物中添加50μL不同濃度的試驗樣品，并以100 μL 10 μmol·L-1FeSO4和 100 μL 0.1 mmol·L-1維生素C于37℃反應1 h以引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應。反應后，隨即以500μL 28%的三氯乙酸和750μL 1%的硫代巴比妥酸于沸水中終止反應。反應物離心去除沉淀，上清液于532 nm下測定吸光值，并按下式計算各提取物對脂質(zhì)過氧化的抑制率。本試驗為3次重復。

式中:Ka為試驗組反應速率;KC為對照組反應速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 山竹果皮各可溶部分總酚含量

山竹果皮乙醇提取物濃縮液經(jīng)由液液分配萃取初步分為二氯甲烷可溶部分、正丁醇可溶部分、水可溶部分以及水不可溶部分4個部分。各個可溶部分干燥粉末在乙醇提取物中的比例及總酚含量測定結(jié)果見表1。

表1 山竹果皮乙醇提取物的總酚含量Tab.1 Total phenolic contents of ethanolic extracts from mangosteen pericarp

從表1可以看出，正丁醇可溶部分總酚含量最高，然后依次是乙醇提取物、二氯甲烷可溶部分及水可溶部分，總酚含量差異顯著 (P〈0.05)。

2.2 山竹果皮各可溶部分的抗氧化活性

2.2.1 DPPH 自由基清除效應

山竹果皮乙醇提取物及各可溶部分供氫的能力可由清除DPPH自由基能力得到。圖1為山竹果皮乙醇提取物及各可溶部分清除DPPH自由基的結(jié)果。

從圖1可以看出乙醇提取物及各個可溶部分的清除率隨濃度的增加而增大。比較各個可溶部分的清除率，以正丁醇可溶部分最大，其次為乙醇提取物、二氯甲烷可溶部分，而以水可溶部分的清除效果最差。經(jīng)計算，正丁醇可溶部分的IC50為10.7 μg·mL-1，乙醇提取物、二氯甲烷可溶部分及水可溶部分 IC50分別為 21.8、28.9 及 48.1 μg·mL-1。根據(jù)楊冬梅［14］的研究結(jié)果，DPPH自由基的清除能力與多酚類含量成正比，而本試驗結(jié)果也證實，山竹果皮的酚類化合物含量愈多，對DPPH自由基的清除率越高。

圖1 山竹果皮提取物清除DPPH自由基的能力Fig.1 Free-radical scavenging activity of the extracts from mangosteen pericarp by DPPH assay

2.2.2 超氧自由基作用

山竹果皮乙醇提取物及各可溶部分清除超氧自由基能力的結(jié)果如圖2所示。從圖2可見，隨著提取物濃度的增高，超氧自由基的清除能力也隨之增大。其中，以正丁醇可溶部分對超氧自由基的清除最為顯著 (IC50為7.2μg·mL-1)，其次分別為乙醇提取物、水可溶部分及二氯甲烷可溶部分 (IC50分別為11.6、23.0、46.2 μg·mL-1)。

圖2 山竹果皮提取物清除超氧自由基的能力Fig.2 Superoxide free radical scavenging activity of the extracts from mangosteen pericarp

2.2.3 β-胡蘿卜素漂白的抑制效果

山竹果皮提取物及各可溶部分對β-胡蘿卜素漂白的抑制效果如圖3所示。從圖3可以看出，乙醇提取物及其正丁醇可溶部分對β-胡蘿卜素漂白的抑制率均比兒茶素好。經(jīng)計算，乙醇提取物及其正丁醇可溶部分對β-胡蘿卜素漂白的IC50值分別為537μg·mL-1和 469μg·mL-1，而兒茶素的IC50值大于 2000 μg·mL-1。

圖3 山竹果皮提取物對β-胡蘿卜素漂白的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of the extracts from mangosteen pericarp onβ-carotene bleaching

2.2.4 還原力的測定

乙醇提取物及各可溶部分還原力的強弱如圖4所示。圖4結(jié)果顯示，乙醇提取物及各可溶部分的還原力隨濃度的增加而增大，濃度在100μg·mL-1時，正丁醇可溶部分、乙醇提取物、水可溶部分及二氯甲烷可溶部分于在700 nm的吸光值分別為1.6、1.2、0.9及0.8，此結(jié)果表明，正丁醇可溶部分的還原力最佳，其次為乙醇提取物、水可溶部分，而以二氯甲烷可溶部分的還原力最差。

圖4 山竹果皮提取物的還原力Fig.4 Reducing power of the extracts from mangosteen pericarp

2.2.5 抗脂質(zhì)過氧化試驗

山竹果皮乙醇提取物及各可溶部分抑制脂質(zhì)過氧化能力如圖5所示。由圖5結(jié)果可知乙醇提取物及各可溶部分對脂質(zhì)過氧化的抑制能力隨濃度的增加而增大，其中，正丁醇可溶部分的抑制脂質(zhì)過氧化能力最佳，其次為二氯甲烷可溶部分及乙醇提取物，水可溶部分抑制脂質(zhì)過氧化能力最差。

圖5 山竹果皮提取物的抑制脂質(zhì)過氧化能力Fig.5 Inhibitory lipid peroxidation activity of the extracts from mangosteen pericarp

3 討論

本文利用DPPH自由基清除、超氧自由基清除、β-胡蘿卜素漂白、還原力及抗脂質(zhì)過氧化等試驗方法評估了山竹果皮提取物的抗氧化活性，試驗結(jié)果表明，山竹果皮提取物各部分中均以正丁醇可溶部分抗氧化活性最好。各部分總酚含量依次為正丁醇可溶部分〉二氯甲烷部分〉水可溶可溶部分。綜合上述試驗結(jié)果，山竹果皮具有較高的抗氧化能力，因此有必要對山竹進行深入的研究，并評估其抗氧化應用的可行性。

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