黃 英

（云南省麗江市食品藥品檢驗所，云南 麗江 674100）

根據(jù)《中國藥典》2010年版規(guī)定，在進行藥品微生物限度檢查時，應(yīng)對所用方法進行驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查［1］。有些中成藥含有較強的抑菌成分，由于抑菌成分的干擾，采用常規(guī)法進行微生物限度檢查，其結(jié)果不能真實反映其污染的微生物的狀況。為使檢測結(jié)果科學(xué)、準(zhǔn)確，檢測前應(yīng)進行方法學(xué)驗證。本文通過對乙肝清熱解毒片等中成藥進行方法學(xué)驗證試驗，結(jié)果表明：對具有抑菌作用的中成藥，其抑菌作用的強弱不同，進行微生物限度檢查時，要消除其抑菌活性所采用的方法也不同。

1 試驗材料

1.1 菌種 枯草桿菌［CMCC（B）63501］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］均由云南省食品藥品檢驗所提供。

1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂、營養(yǎng)肉湯、改良馬丁、改良馬丁瓊脂，MUG、麥康凱瓊脂、膽鹽乳糖、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基為北京三藥科技開發(fā)公司和北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司生產(chǎn)。按規(guī)定進行培養(yǎng)基的適用性檢查為合格。稀釋劑為pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液。

1.3 樣品 乙肝清熱解毒片等中成藥共12個品種見表1。

2 方法與結(jié)果

按《中國藥典》2010年版微生物限度檢查法［1］進行驗證。

2.1 菌液制備

2.1.1 取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸埃希菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10－5～10－7，使成50～100cfu·mL－1，經(jīng)活菌計數(shù)后備用。

2.1.2 取經(jīng)23～28℃ 培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養(yǎng)物1mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10－5～10－6，使成50～100cfu·mL－1，經(jīng)活菌計數(shù)后備用。

2.1.3 取經(jīng)23～28℃培養(yǎng)1周的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，用5mL含0.05%（mL／mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸出孢子懸液1mL至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL／mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。

2.2 供試液制備 稱樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，得1∶10供試液。

2.3 驗證試驗 細菌、霉菌與酵母菌計數(shù)方法的驗證，進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。若試驗組的菌回收率均不低于70%，可按該供試液制備方法和計數(shù)方法測定供試品的細菌、霉菌與酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用稀釋法、薄膜過濾法等消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。

2.3.1 平皿菌落計數(shù)法（常規(guī)法） 取供試液（1∶10）1mL入皿，然后每皿加營養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，搖勻，按《中國藥典》2010年版附錄微生物限度檢驗方法進行。各試驗菌回收率結(jié)果見表1。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 取上述供試液（1∶10）1mL，注入5個平皿中（每平皿0.2mL），然后每皿加營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，搖勻，按《中國藥典》2010年版附錄微生物限度檢驗方法進行。各試驗菌回收率結(jié)果見表2。

2.3.3 薄膜過濾法 取上述供試液（1∶10）1mL，加入置有100mL沖洗液的濾器中，經(jīng)減壓抽濾干凈后，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗，每次約100mL，共沖洗400mL／膜，在最后1次沖洗液中加入50～100cfu。濾干后取膜，菌面向上貼于營養(yǎng)瓊脂平板，經(jīng)35℃培養(yǎng)3d后，點計菌落數(shù)。各試驗菌回收率結(jié)果見表2。

表1 乙肝清熱解毒片等中成藥常規(guī)法（1mL／皿）各試驗菌回收率（%）

表2 培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL／皿）和薄膜過濾法回收率（%）

2.4 控制菌檢查驗證試驗 試驗組：取規(guī)定量供試液及10～100cfu試驗菌株，加入相應(yīng)規(guī)定量的培養(yǎng)基中，按各控制菌檢查法檢查。樣品組：取規(guī)定量供試液，加入相應(yīng)規(guī)定量的培養(yǎng)基中，按各控制菌檢查法檢查。

3 結(jié)果分析

3.1 結(jié)果表明 乙肝清熱解毒片等中成藥對5株陽性代表菌有不同程度的抑菌活性。如乙肝清熱解毒片對大場埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉無抑菌作用，如常規(guī)法（1mL／皿）試驗菌回收率大場埃希菌分別為78%、85%、77%。對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用，而且乙肝清熱解毒片對枯草芽孢桿菌的抑菌作用比對金黃色葡萄球菌的抑菌作用強。

3.2 表1所見，珍菊降壓片、保兒寧顆粒、傷痛寧片、天麻頭風(fēng)靈膠囊 、養(yǎng)血安神片對5種陽性對照菌的回收率均高于70%，無抑菌作用，因此平皿菌落計數(shù)法（常規(guī)法）可用于此5種中成藥的微生物限度檢查。益脈康膠囊、清肺抑火膠囊、乙肝清熱解毒片、平肝疏絡(luò)丸、清開靈滴丸、丹參益心片、同仁牛黃清心丸對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有明顯的抑菌作用，回收率均低于70% 。

3.3 表1所述中成藥，對大腸埃希菌、霉菌和酵母菌無抑菌作用，回收率高于70%，因此平皿菌落計數(shù)法（常規(guī)法）可用于上述12種中成藥的大腸埃希菌、霉菌和酵母菌的計數(shù)檢查。

3.4 表2所見：經(jīng)培養(yǎng)基稀釋（每平皿0.2mL），益脈康膠囊、清肺抑火膠囊、乙肝清熱解毒片、平肝疏絡(luò)丸已無明顯抑菌能力，回收率均高于70%，表明培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL／皿）可用于上述4種中成藥的微生物限度檢查。清開靈滴丸、丹參益心片、同仁牛黃清心丸常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL／皿）檢驗時對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有很強的抑菌作用，回收率低于70%，采用薄膜過濾法，回收率均大于70%，因此，薄膜過濾法可用于清開靈滴丸、丹參益心片、同仁牛黃清心丸的微生物限度檢查。

3.5 控制菌檢查結(jié)果 試驗組檢出試驗菌，樣品組未檢出控制菌。各必檢控制菌均可用常規(guī)法檢查。

4 討論

4.1 選擇適當(dāng)?shù)臋z查方法，可提高微生物檢出率。對無抑菌作用的中成藥，用常規(guī)法進行藥品的微生物限度檢查，對于抑菌作用較強的中成藥，用培養(yǎng)基稀釋法簡便有效，對于抑菌作用很強的中成藥，用稀釋法難以消除供試品的抑菌作用，可選用薄膜過濾法或是幾種方法聯(lián)用消除其抑菌活性，使檢查結(jié)果更真實反映藥品的污染情況。

4.2 乙肝清熱解毒片等上述12種中成藥進行細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法驗證時，試驗菌株僅選用金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌2株菌即可，這樣即可保證檢驗方法的有效性，又節(jié)省了大量的人力和物力。

［1］中華人民共和國，中國藥典［S］.北京：化工出版社，2010.79～88.