劉傳統(tǒng)，祁 紅

（湖南省石門縣人民醫(yī)院，湖南 石門 415300）

健脾養(yǎng)胃口服液由黨參、白芍、白術(shù)、陳皮等10味中藥組成，具有健脾養(yǎng)胃之作用，對(duì)胃潰瘍、十二指潰瘍等有較好療效。為控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床療效，本文建立了健脾養(yǎng)胃口服液中白術(shù)、白芍、陳皮的薄層色譜鑒別方法，并采用高效液相色譜法對(duì)其中主要藥味陳皮的主要成分陳皮苷、白芍的主要成分芍藥苷的含量進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC－10AT高效液相色譜儀，SPD－10Avp紫外檢測(cè)器，CLASS－VP色譜工作站。Meter AE240電子天平。

1.2 試藥 硅膠G，青島海洋化工廠，甲醇、乙腈為色譜純，其他均為分析純。陳皮苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110721－200211，供含量測(cè)定用）、芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110736－200424，供含量測(cè)定用）。健脾養(yǎng)胃口服液為本院生產(chǎn)，（批號(hào)：111015、111021、111114）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別［1］

2.1.1 白術(shù) 取本品10mL，加乙酸乙酯振搖提取2次，每次10mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取白術(shù)對(duì)照藥材0.5g，加水50mL，煎煮30min，濾過(guò)，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次10mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。另取按處方要求制成缺白術(shù)的陰性供試品10mL，同供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法實(shí)驗(yàn)，吸取上述供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10～15μL及對(duì)照品溶10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－丙酮（10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，在100℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液則無(wú)，見(jiàn)圖1。

圖1 白術(shù)的TLC鑒別

2.1.2 白芍 取本品20mL，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，加入中性氧化鋁2g拌勻，水浴上蒸干，加在中性氧化鋁柱（100～200目，4g，內(nèi)徑為0.8～1cm）上，用甲醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取缺白芍的陰性供試品，同供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（40∶5∶10∶2）為展開劑展開，取出，晾干。噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。在日光下檢視，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對(duì)照液則無(wú)。見(jiàn)圖2。

圖2 白芍的TLC鑒別

2.1.3 陳皮 取本品20mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。另取陳皮對(duì)照藥材1g，加水60mL，煮沸1h，濾過(guò)，濾液同法制成對(duì)照藥材溶液。取缺陳皮的陰性供試品，同供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲醇－水（100∶17∶13）為展開劑展開至約3cm，取出，晾干，再以甲苯－乙酸乙酯－甲酸－水（20∶10∶1∶1）的上層溶液為展開劑，展至約8cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照液則無(wú)。見(jiàn)圖3。

圖3 陳皮的TLC鑒別

2.2 陳皮苷的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品的制備 精密稱取陳皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含21.6μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取樣品5mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，加甲醇至50mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：大連依利特 HypersilODS2（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.1%磷酸溶液（40∶60）；流速：0.7mL·min－1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：283nm；理論塔板數(shù)按陳皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液5、8、10、12、15μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品量X（μg）為橫坐標(biāo)，作線性回歸，得回歸方程Y＝2577784.962X＋2208.048，r＝0.9995，結(jié)果表明陳皮苷在0.108μg～0.324μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測(cè)定，陳皮苷面積積分值的平均值為557974，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝0.34%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品（111015）6份，分別按樣品測(cè)定方法測(cè)定。結(jié)果：陳皮苷平均含量為1.63mg·mL－1，RSD＝1.08%。

2.2.7 空白試驗(yàn) 取缺陳皮的陰性對(duì)照溶液，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果表明處方中其他藥味無(wú)干擾。圖4。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24h進(jìn)樣（10μL），共進(jìn)樣6次，按上述色譜條件分別測(cè)定陳皮苷，峰面積積分值RSD＝0.81%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品（批號(hào)：111015）3mL，精密加入一定量陳皮苷對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2，色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 陳皮苷的HPLC色譜圖

表2 樣品的含量測(cè)定結(jié)果 （n＝3）

2.3 芍藥苷的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品的制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含50μg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取樣品2mL置25mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 色譜條件 色譜柱：大連依利特 HypersilODS2（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.1%磷酸溶液（14∶86）；流速：1mL·min－1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：232nm；理論塔板數(shù)按芍藥苷計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液5、8、10、12、15μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品量X（μg）為橫坐標(biāo)，作線性回歸，得回歸方程Y＝1662771.379X－2840.890，r＝0.9999，結(jié)果表明芍藥苷在0.25μg～0.75μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測(cè)定，芍藥苷峰面積積分值的平均值為825677，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝0.46%。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品（111015）6份，分別按樣品測(cè)定方法測(cè)定。結(jié)果：芍藥苷平均含量為0.635mg·mL－1，RSD＝1.04% .

2.3.7 空白試驗(yàn) 取缺白芍的陰性對(duì)照溶液，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果表明處方中其他藥味無(wú)干擾。見(jiàn)圖5。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24h進(jìn)樣（10μL），共進(jìn)樣6次，按上述色譜條件分別測(cè)定芍藥苷，峰面積積分值RSD＝0.64%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品（批號(hào)：111015）1mL，精密加入一定量芍藥苷對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.10 樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4，色譜圖見(jiàn)圖2。

表4 樣品的含量測(cè)定結(jié)果 （n＝3）

圖5 芍藥苷測(cè)定的HPLC色譜圖

3 討論

陳皮苷的含量測(cè)定試驗(yàn)采用流動(dòng)相甲醇－0.1%磷酸（40∶60），流動(dòng)相甲醇－乙腈 －0.1%磷酸（12∶14∶74），結(jié)果陳皮苷采用流動(dòng)相甲醇－0.1%磷酸（40：60）可以基線分離不受其他組分干擾，分離效果好，準(zhǔn)確度高。芍藥苷的含量測(cè)定試驗(yàn)參考文獻(xiàn)［2］白芍項(xiàng)下芍藥苷的含量測(cè)定方法，采用流動(dòng)相甲醇－0.05mol·L－1磷酸二氫鉀（30∶70），流動(dòng)相乙腈－0.1%磷酸（14∶86），流動(dòng)相乙腈－0.1%磷酸（15∶85），結(jié)果芍藥苷采用流動(dòng)相乙腈－0.1%磷酸（14∶86）可以基線分離不受其他組分干擾，分離效果好，準(zhǔn)確度高。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì) .中華人民共和國(guó)藥典［S］（一部）.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：665～1010.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì) .中華人民共和國(guó)藥典［S］（一部）.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：504.