杜善平，齊宗利，王亞琴，陳麗紅，唐治國，王光華，張 健

(1陜西省人民醫(yī)院，西安710068;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

EZH2蛋白為PcG蛋白家族成員之一，是果蠅蛋白E(z)在人體的同源生物大分子［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EZH2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2，3］。子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，為女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一，其預(yù)后與腫瘤分期、有無轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。關(guān)于EZH2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和意義，國內(nèi)外研究報道較少。本研究旨在檢測子宮內(nèi)膜癌組織中EZH2的表達(dá)情況，并探討其與內(nèi)膜癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2007年1月～2010年10月陜西省人民醫(yī)院行手術(shù)及活檢的子宮內(nèi)膜癌患者48例，年齡28～80歲，中位年齡56歲，其中＜60歲20例，≥60歲28例;局限型19例，彌漫型29例。臨床分期按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟1971年標(biāo)準(zhǔn)分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期9例，Ⅲ期23例，Ⅳ期4例;組織學(xué)類型分為:子宮內(nèi)膜樣腺癌45例，非子宮內(nèi)膜樣腺癌3例;肌層浸潤≥1/2的子宮內(nèi)膜癌29例，肌層浸潤＜1/2的子宮內(nèi)膜癌 19例;分化程度:高分化22例，中分化12例，低分化14例;23例有淋巴轉(zhuǎn)移，25例無淋巴轉(zhuǎn)移。所有病例在未行放療、化療及性激素類藥物治療前取得組織標(biāo)本，由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師復(fù)查HE切片核實(shí)診斷。另取同期獲取的子宮內(nèi)膜正常者24例和子宮內(nèi)膜增生癥26例作為對照，其性別、年齡與子宮內(nèi)膜癌患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法檢測 上述組織石蠟包埋標(biāo)本4μm厚切片行如下處理:浸泡于二甲苯中脫蠟、浸泡于梯度乙醇中水化，通過用高壓抗原修復(fù)，3%H2O2去除非特異性過氧化物酶，正常10%山羊血清封閉。先后滴加一抗(EZH2)、二抗，試劑盒C液(過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素抗生物素)、新鮮配制的DAB溶液，蘇木精復(fù)染、中性樹膠封片，鏡下觀察。以正常子宮內(nèi)膜組織做陽性對照，用PBS代替一抗做空白對照。

1.2.2 原位雜交檢測 切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3×5 min。3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37℃消化30 min，充分暴露mRNA核酸片段。0.5 mol、pH 7.4的PBS緩沖液振洗3×5 min。滴加阻斷液，40℃作用2 h，以阻止非特異性的雜交;傾去，勿洗。滴加預(yù)雜交液，40℃作用2 h;傾去，勿洗。滴加雜交液，42℃雜交過夜。30～37℃水溫的2×SSC緩沖液振洗2×15 min，滴加封閉液，37℃ 30 min;傾去，勿洗。滴加抗地高辛抗體堿性磷酸酶復(fù)合物，37℃ 60 min。0.5 mol、pH 7.4 的PBS 緩沖液振洗4 ×5 min。DBA顯色，蘇木精襯染，鹽酸乙醇分化，脫水透明，封片，以正常子宮內(nèi)膜組織做陽性對照，預(yù)雜交液代替雜交液做陰性對照。

1.2.3 光鏡觀察 免疫組織化學(xué)染色EZH2主要定位于細(xì)胞核，但部分細(xì)胞質(zhì)也有著色，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。原位雜交檢測EZH2主要是以胞質(zhì)著色為主。二者采用統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)［4］，根據(jù)染色細(xì)胞百分率及染色強(qiáng)度進(jìn)行評定。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SSPS13.0軟件包，不同組織間EZH2表達(dá)比較采用χ2檢驗、Fisher精確概率法檢驗以及多因素Logistic回歸分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種組織間EZH2的表達(dá) 48例子宮內(nèi)膜癌中，EZH2蛋白及EZH2 mRNA的表達(dá)陽性率分別為70.8%(34/48)、64.6%(31/48);24 例子宮內(nèi)膜正常組織中EZH2蛋白及EZH2 mRNA的表達(dá)陽性率為16.7%(4/24)、12.5%(3/24);26 例子宮內(nèi)膜增生癥中EZH2蛋白及EZH2 mRNA的表達(dá)陽性率為23.1%(6/26)、19.2%(5/26)。三種組織間 EZH2蛋白及EZH2 mRNA表達(dá)陽性率比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P 均 ＜0.01)。

2.2 EZH2表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 EZH2蛋白和EZH2 mRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 EZH2蛋白表達(dá)相關(guān)的多因素分析 多因素分析顯示淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期及肌層浸潤與EZH2蛋白陽性表達(dá)有關(guān)(P均＜0.05)，與腫瘤的病理分級及大體類型無關(guān)(P＞0.05)。見表2。

表2 EZH2蛋白表達(dá)相關(guān)的多因素分析

3 討論

研究表明，EZH2表達(dá)水平與許多腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，隨著腫瘤的惡性演進(jìn)，EZH2蛋白的表達(dá)增高［5～7］。Raman等用 RT-PCR 研究 38例膀胱組織標(biāo)本中EZH2 mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)14例非瘤性膀胱組織中有5例EZH2 mRNA表達(dá)陽性，膀胱癌組織24例中有21例EZH2 mRNA表達(dá)陽性二者相比有統(tǒng)計學(xué)差異。同時發(fā)現(xiàn)在浸潤性膀胱癌中其表達(dá)率為100%，而在非浸潤性膀胱癌中其表達(dá)率為79%;并且EZH2 mRNA表達(dá)和病理分級呈正相關(guān)。與此同時，Ramman等用免疫組織化學(xué)對39例膀胱癌中EZH2蛋白表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，EZH2蛋白的表達(dá)情況基本與EZH2 mRNA表達(dá)一致，但浸潤性膀胱癌和非浸潤性相比EZH2蛋白的表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異，而且正常膀胱組織與低級別的膀胱癌組織相比EZH2蛋白的表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異，而與高級別的膀胱癌組織相比EZH2蛋白表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌中EZH2蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于正常子宮內(nèi)膜和增生癥子宮內(nèi)膜，并且單因素分析表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、肌層浸潤深度、細(xì)胞分化程度及腫瘤是否局限與EZH2蛋白的表達(dá)顯著相關(guān)，而多因素分析結(jié)果顯示EZH2蛋白的表達(dá)只與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及肌層浸潤深度相關(guān)，這與在其他惡性腫瘤中的研究結(jié)果基本一致，提示EZH2蛋白的高表達(dá)與內(nèi)膜癌的惡性程度相關(guān)。

由于本研究屬于回顧性研究，采用的原位雜交及免疫組織化學(xué)檢測方法敏感性較RT-PCR差，因此關(guān)于EZH2是否可以用于預(yù)測內(nèi)膜癌的惡性程度尚需進(jìn)一步研究。另外，內(nèi)膜癌中EZH2與年齡及病理分型無顯著相關(guān)性，究其原因可能是由于其他的子宮內(nèi)膜癌樣本量太少，不足以顯示差別，還需要進(jìn)一步實(shí)驗驗證。

到目前為止，EZH2的作用機(jī)制還不是很明確。EZH2蛋白具有組蛋白H3甲基轉(zhuǎn)移酶活性、組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶(HADC)和基因外的多種調(diào)控作用，其生物活性的發(fā)揮依賴于HDAC活性及完整的SET結(jié)構(gòu)域，通過組蛋白乙?；种苿?如TSA)可以消除其效果，因此推測其可能作用機(jī)制是EEDEZH2復(fù)合物→HDAC+SET→轉(zhuǎn)錄抑制→基因沉默，并且提示HDAC抑制劑將成為EZH2高表達(dá)腫瘤的新的治療方案［8］。最近研究發(fā)現(xiàn)，周期素依賴性激酶1介導(dǎo)的EZH2磷酸化可調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性，主要是磷酸化的EZH2促使其泛素化，最終被降解，從而不利于細(xì)胞增殖，這種調(diào)控機(jī)制對藥物治療提供了新的思路［9］。也有研究發(fā)現(xiàn)病毒對EZH2有激活作用，從而促進(jìn)腫瘤不斷增殖［10］。

總之，本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌中EZH2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)，并對預(yù)后有一定的影響。對EZH2在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用研究將有助于揭示子宮內(nèi)膜癌發(fā)生機(jī)制，并可以發(fā)現(xiàn)更多的治療靶點(diǎn)，從而有利于為子宮內(nèi)膜癌患者選擇個體化治療方案。

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