向 敏，陳志華，高其雙，黃海軍，陶弼菲，占才耀，王連芳，李 杰

（湖北省武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北 武漢 430065）

牛睪丸原代細胞是目前生產(chǎn)細胞型豬瘟弱毒疫苗的最主要細胞源。全國每年用于生產(chǎn)豬瘟弱毒疫苗的牛睪丸約為70萬對，但牛的產(chǎn)仔具有相對嚴格的季節(jié)性，且同一個牛場每天的睪丸產(chǎn)量是極其有限的。這給疫苗生產(chǎn)廠家批量收集睪丸以及調(diào)劑生產(chǎn)周期等方面帶來了困難。另外，經(jīng)常不斷的從外界送入生鮮睪丸組織，增加了藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）車間的污染頻率，因此，進入GMP車間用于生產(chǎn)豬瘟疫苗的牛睪丸細胞最好是經(jīng)檢測無污染并能產(chǎn)出高效價病毒的合格細胞。但是，牛睪丸細胞傳代次數(shù)是有限的。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，牛睪丸細胞接種豬瘟病毒只適合傳5代次［1］。很明顯，以現(xiàn)有的凍存管凍存技術(shù)凍存牛睪丸細胞等待檢測結(jié)果，再將其解凍用于大容量轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)是不可能的，只有采取大容量批量凍存技術(shù)建立可靠的健康牛睪丸原代細胞貯備庫才可以做到這一點，目前，國內(nèi)外尚無類似的成熟技術(shù)。本試驗從傳統(tǒng)制作方法的改進，胰酶的消化以及大容量批量凍存等方面改進牛睪丸細胞的原代培養(yǎng)技術(shù)，為研究豬瘟細胞型弱毒疫苗的規(guī)范化生產(chǎn)，提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑 Hank′s液：按標準配方自配。DMEM高糖培養(yǎng)基原液，購自北京清大天一科技有限公司，原液按使用說明書配制，另加入10%血清即成為DMEM高糖工作液。細胞凍存液由45%DMEM原液、45%新生牛血清、10%DMSO混合均勻制得。分別裝入200mL血清袋中，8KGY劑量下輻照5h，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 牛睪丸的采集 剛出生的奶公牛，運入潔凈手術(shù)室，按照常規(guī)操作快速將陰囊皮膚環(huán)切，同時切斷皮下筋膜、附睪、血管等組織，用一根細繩在術(shù)者兩手手指尖離切口約1cm處結(jié)扎，用浸滿碘酊的棉花條沿切口向后將整個陰囊包裹，裝入采樣袋中，放入裝有冰袋的泡沫箱內(nèi)存放備用。

1.3 原代細胞制作

1.3.1 試驗設(shè)計 選擇3對牛睪丸作為試驗對象，分別用含有Hank′s液的2.5%胰蛋白酶+0.02%EDTA，5.0%胰蛋白酶+0.02%EDTA以及2.5%胰蛋白酶三種不同消化方法分離牛睪丸細胞。

1.3.2 操作方法 從樣品袋中取出陰囊，在超凈工作臺內(nèi)無菌操作，用眼科鑷子夾住露于陰囊切口外的附睪或睪丸系膜組織，將睪丸放入盛有 Hank′s液的平皿中，用含有雙抗的Hank′s液反復(fù)洗滌，再將睪丸放入另一干燥平皿內(nèi)，用眼科剪剪去睪丸表皮，繼續(xù)用含雙抗的Hank′s液洗滌1～2次，將洗好的去皮睪丸稱重，然后將睪丸組織剪成厚約0.2 cm的碎片，轉(zhuǎn)入一個裝有玻璃珠并經(jīng)高溫滅菌處理的抽濾瓶中，繼續(xù)向抽濾瓶中加入細胞消化液直至浸沒全部玻璃珠及其上放置的睪丸組織，放置于37℃水浴鍋中消化30min，在超凈工作臺內(nèi)慢慢將消化液倒出，再向瓶中加入DMEM工作液進行中和，倒去培養(yǎng)基，強烈振搖，使消化后的睪丸細胞充分從組織塊上分離出來，再用培養(yǎng)基沖洗玻璃珠，洗液即成為細胞懸液，倒入細胞瓶中，放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 凍存與解凍操作 當睪丸細胞分離后，按照每3.5g睪丸組織加入200mL凍存液的標準制成細胞懸液，分裝入凍存袋中，每袋200mL，將其分別放入一適當大小的泡沫箱內(nèi)和鐵盒內(nèi)，并放入-80℃的冰箱中讓其自然凍結(jié)。另取少量細胞懸液放入若干個凍存管，按照常規(guī)凍存方法作檢測備用樣品。

分別在細胞凍存后的第30、120、360天取部分細胞進行解凍。將泡沫箱內(nèi)的細胞袋和鐵盒中的細胞袋解凍離心后輕輕移入超凈工作臺內(nèi)倒出上清液，用DMEM工作液重懸細胞，取樣計數(shù)，將重懸細胞液導(dǎo)入10000mL的轉(zhuǎn)瓶中，補加培養(yǎng)基至1000mL，于37℃下轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。對照組按傳統(tǒng)方法進行解凍培養(yǎng)。

1.5 細胞存活率檢測 細胞懸液和臺盼藍染液按1∶1（V∶V）的比例混合，染色2～3min后在倒置顯微鏡下用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，并區(qū)分出活細胞和死細胞以計算細胞活力。

1.6 細胞貼壁率檢測及細胞形態(tài)學(xué)觀察 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)8h后，在轉(zhuǎn)瓶顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并取少量培養(yǎng)液樣品，血球計數(shù)板計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代細胞 見表1。

表1 牛睪丸細胞特征

從表1中可以看出，牛睪丸細胞經(jīng)2.5%胰蛋白酶消化的細胞活力最高。

2.2 細胞凍存與復(fù)蘇 見表2。

從表2中，我們可以看出，改良后的凍存方法特別是泡沫盒凍存和傳統(tǒng)的凍存方法細胞復(fù)蘇活力差別不大，但是，由于牛睪丸細胞傳代次數(shù)的限制性，我們最終選用泡沫箱凍存。

2.3 細胞生長 細胞經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)8h后，均已貼壁完好，部分細胞已開始拉伸變長，24h后，細胞已全部變成成纖維細胞樣，個別未分散的細胞團則呈島狀生長，向周邊呈放射狀生長出纖維樣細胞。48h后，細胞間已基本無間隙，細胞長滿瓶壁（見圖1），可用于傳代。

從表3中可以看出，改良后的凍存方法特別是泡沫盒凍存的細胞在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)上細胞貼壁率最高，而用傳統(tǒng)的方法和鐵盒凍存細胞在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)貼壁率上明顯降低。

3 討論

圖1 復(fù)蘇細胞培養(yǎng)48h牛睪丸細胞形態(tài)

表3 復(fù)蘇后細胞貼壁8 h生長率 （%）

牛睪丸原代細胞是豬瘟弱毒細胞性疫苗生產(chǎn)的主要細胞源，目前國內(nèi)普遍采用生鮮牛睪丸，不僅采集成本高，而且對GMP車間污染的可能性以及篩選合格的睪丸組織所造成的生產(chǎn)資源浪費都較大，本試驗將牛睪丸原代細胞進行大容量批量凍存，其解凍存活率與生鮮原代細胞無顯著差異，這為建立專業(yè)化牛睪丸原代細胞貯備庫提供了技術(shù)參考。

豬瘟弱毒病毒的培養(yǎng)采用的是牛睪丸原代細胞帶毒培養(yǎng)技術(shù)，其最優(yōu)收毒代次為3～5代，這要求細胞的起始培養(yǎng)單位不能太?。?］，以免細胞達到工廠化生產(chǎn)培養(yǎng)單位所需的擴增代次太多。目前國內(nèi)普遍采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)，將原代細胞分離后直接上轉(zhuǎn)瓶，因此凍存細胞每個凍存單位的細胞量必須達到一個轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)所需的細胞量。本試驗證明，用常規(guī)接種一個轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)所需的細胞總量凍存在一個凍存容量（200mL凍存袋）中，解凍后細胞存活率、貼壁率、生長行為無顯著變化［6-8］，這就實現(xiàn)了細胞凍存與工廠化培養(yǎng)的直接對接。

本項試驗中，牛睪丸細胞最長凍存期限僅為360d，其極限凍存時限有待進一步研究。細胞凍存溫度為-80℃，而不是常規(guī)的液氮凍存，這是因為：所用的細胞凍存袋為聚乙烯類塑料，該材質(zhì)在低溫下易于老化，在液氮溫度下，該材質(zhì)還容易炸裂，因此在細胞凍存的包裝材料上尚需進一步研究。

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