黃顯明，張小飛，尹秀鳳，王 偉，靳雨田

（南京天邦生物科技有限公司，江蘇 南京 211102）

自2006年以來，山東、江蘇、浙江、福建、安徽等養(yǎng)鴨比較密集的地區(qū)相繼出現(xiàn)了一種新的傳染性疾病，臨床表現(xiàn)為軟腿，生長(zhǎng)發(fā)育不良，剖檢以脾臟有白色壞死灶為主要病變特征，死亡率大約在20%左右，因而臨床上大多稱“鴨脾壞死癥”［1］。近兩年，該病情越來越嚴(yán)重，造成雛鴨大批死亡，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于該病的病原，至今還沒有一個(gè)明確的定論。本研究通過患病鴨體內(nèi)分離病毒、動(dòng)物回歸試驗(yàn)、理化特性、分子生物學(xué)等方法進(jìn)行病原鑒定，最終分離鑒定出1株新型鴨源呼腸孤病毒。初步結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源 病料來自安徽安慶周邊地區(qū)疑似脾壞死癥的某櫻桃谷肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)。無菌采集14日齡病死鴨的肝、脾等組織，按1∶5加入滅菌生理鹽水，充分研磨勻漿并反復(fù)凍融三次后，4℃，8000r／min離心5min，取上清液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和禽胚 4日齡雛鴨和10日齡鴨胚，購自安徽和縣健康鴨場(chǎng)。

1.3 病毒分離與傳代 將處理好的病料樣品經(jīng)尿囊腔接種10日齡鴨胚，共5枚，每枚0.3mL，接種后置37℃下繼續(xù)孵化觀察144h。接種后收獲死亡的鴨胚尿囊液繼續(xù)盲傳3代，收集死胚胚液，置于-20℃保存?zhèn)溆谩Ａ磉x取長(zhǎng)滿單層的鴨胚成纖維細(xì)胞，接種0.5mL病料上清，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立未接毒的正常細(xì)胞做對(duì)照。每日觀察，待DEF產(chǎn)生80%細(xì)胞病變，收獲病毒或連續(xù)盲傳3代。

1.4 病毒對(duì)氯仿敏感性測(cè)定 參考文獻(xiàn)［2］，在單層DEF上測(cè)定分離毒對(duì)氯仿的敏感性。

1.5 病毒的血凝性測(cè)定 參考文獻(xiàn)［2］，測(cè)定分離毒對(duì)雞紅細(xì)胞的血凝性。

1.6 序列測(cè)定與分析 根據(jù)鴨源呼腸孤病毒的S2基因序列，設(shè)計(jì)合成了1對(duì)特異性的引物，S2F：5′-ATGGCGCGTGCCGTGTAC-3′，S2R：5′-CTGGACGGTAAAAGTGGC-3′。目的片段大小為1251bp。對(duì)獲得的死胚尿囊液進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化后，送往上海美吉生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，用DNAStar等分子生物學(xué)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn) 對(duì)5只3日齡的健康雛鴨進(jìn)行皮下注射第2代含毒尿囊液，每羽0.5mL，另設(shè)5只雛鴨作對(duì)照，隔離飼養(yǎng)觀察，連續(xù)觀察7d，記錄試驗(yàn)鴨發(fā)病情況及病死鴨病變。試驗(yàn)結(jié)束后，采集攻毒鴨脾臟樣品進(jìn)行病毒的再分離，以RT-PCR方法進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 流行情況及臨床癥狀 2011年4月份，安徽安慶市周邊地區(qū)發(fā)生一種以軟腿，行走困難嚴(yán)重者發(fā)生癱瘓，腹瀉排白色糞便，生長(zhǎng)發(fā)育不良，部分鴨爪部彌漫性出血為臨床特征的鴨病，發(fā)病日齡從4日齡開始，死亡率在20%左右，而且發(fā)病日齡越小，死亡率越高。剖檢可見心內(nèi)膜少量出血點(diǎn)；肝臟點(diǎn)狀出血、質(zhì)脆；膽囊腫大，膽汁滲出；腎臟微腫；胰腺表面散在出血點(diǎn)；脾臟腫大、邊緣增生、表面存在白色壞死灶甚至呈紫黑色實(shí)變等。

2.2 病毒分離結(jié)果 無菌過濾處理的病料上清液通過尿囊腔接種10日齡鴨胚，基本在接種后96～132h之間全部死亡，收獲死亡的尿囊液連續(xù)盲傳3代，對(duì)照組未出現(xiàn)死亡。死亡鴨胚胚體點(diǎn)狀出血，尿囊液清亮。DEF在接種分離毒后72h開始出現(xiàn)病變，單層細(xì)胞變性出現(xiàn)空泡，拉網(wǎng)；繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞開始圓縮，脫落，而對(duì)照組正常。因此，通過病毒分離，獲得1株病毒分離株，命名為AH株。

2.3 病毒的氯仿敏感測(cè)定 分離毒對(duì)氯仿不敏感，表明分離毒為無囊膜的RNA病毒。

2.4 病毒的血凝性測(cè)定 分離毒不能凝集雞的紅細(xì)胞，表明該分離毒無血凝活性。

2.5 序列測(cè)定與分析 通過RT-PCR方法從AH分離株中擴(kuò)增出一條與預(yù)計(jì)片段大小相符的目的條帶，大小約1200bp（圖1）。目的片段經(jīng)回收測(cè)序，結(jié)果完全正確。經(jīng)過在線Blast程序?qū)y(cè)定的S2基因進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)與鴨源新型呼腸孤病毒NP03株、GZ株、HC株具有高度的核酸同源性，約為97%；與番鴨呼腸孤病毒、鵝源呼腸孤病毒和鴨源呼腸孤病毒的核酸同源性約為93%；與雞源呼腸孤病毒的核酸同源性僅約為77%。因此，初步認(rèn)為該病毒分離株為新型鴨源呼腸孤病毒。禽源呼腸孤病毒的S2基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹表明（圖2），禽源呼腸孤病毒分為兩個(gè)群，分別為雞源呼腸孤病毒群和水禽源呼腸孤病毒群，而且新型鴨源呼腸孤病毒又單獨(dú)分立為一個(gè)亞群，說明了禽源呼腸孤病毒已經(jīng)發(fā)生變異。

圖1 AH株病毒的RT-PCR擴(kuò)增

2.6 動(dòng)物試驗(yàn) 試驗(yàn)組雛鴨攻毒后觀察7d內(nèi)未見試驗(yàn)鴨死亡。剖檢試驗(yàn)組的5只鴨，可見脾臟腫大，邊緣有增生，表面有明顯的白色壞死灶，心內(nèi)膜見少量出血點(diǎn)，對(duì)照組均正常。結(jié)果顯示，AH株攻毒感染致死的雛鴨病變與自然感染病死雛鴨病變相同。采集的試驗(yàn)鴨脾臟組織上清液經(jīng)處理后接種DEF細(xì)胞能夠產(chǎn)生相應(yīng)的病變，并通過RT-PCR擴(kuò)增出該病毒。

3 討論

綜合臨床癥狀、剖檢病變、病原分離鑒定及RTPCR結(jié)果，最終鑒定分離的病毒為新型鴨源呼腸孤病毒。序列分析結(jié)果表明，禽源呼腸孤病毒分為兩個(gè)群，分別為雞源呼腸孤病毒群和水禽源呼腸孤病毒群，而且新型鴨源呼腸孤病毒又單獨(dú)分立為一個(gè)亞群，說明了禽源呼腸孤病毒已經(jīng)發(fā)生變異。張寶來等對(duì)湖北省一些肉鴨場(chǎng)均出現(xiàn)一種以脾臟有大量白色壞死斑塊為特征的急性傳染病進(jìn)行研究，結(jié)果表明，引起以脾臟壞死為主要特征的鴨傳染病病原是禽呼腸孤病毒［3］。梁鮮便等對(duì)南寧市飼養(yǎng)的櫻桃谷鴨發(fā)生具有“脾壞死癥”特征的兩群發(fā)病鴨進(jìn)行病原的分離與鑒定，最終分離到1株鴨源的禽呼腸孤病毒［4］。王劭等對(duì)1株鴨呼腸孤病毒NP03株的S3基因進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明，NP03株的S3基因具有不同于禽呼腸孤病毒和番鴨呼腸孤病毒的特征，認(rèn)為NP03株是一株新型鴨呼腸孤病毒［5］，而且本次分離的AH株和NP03株具有高度同源性。2011年，Liu等首次報(bào)道了呼腸孤病毒引起鴨的“脾壞死癥”［6］。因此，我們認(rèn)為鴨脾壞死癥的病原為新型鴨源呼腸孤病毒。

圖2 禽源呼腸孤病毒的S2基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹

近年來國(guó)內(nèi)外研究表明，禽源呼腸孤病毒已呈現(xiàn)出宿主多樣性的特點(diǎn)，感染后引起的鴨臨床致病型也日益復(fù)雜，目前已報(bào)道有多臟器壞死型、多臟器出血型和脾臟壞死型3種［7］。鴨脾壞死癥幾乎發(fā)生于所有品種鴨，不僅對(duì)番鴨、半番鴨、櫻桃谷鴨易感，最近還報(bào)道對(duì)麻鴨易感［8］。該病尤其對(duì)7～22日齡的雛鴨最易感，可造成20%～80%的發(fā)病率和5%～20%的死亡率。對(duì)于鴨脾壞死癥的防治尚無有效的治療藥物，防治本病的主要方法是采取綜合防制措施。該病毒既可通過水平傳播，也可以垂直傳播，更加難于防治。目前市場(chǎng)上還缺乏針對(duì)性的疫苗，雞源呼腸孤病毒的疫苗和劉思枷等［9］研制的番鴨呼腸孤病毒弱毒疫苗還無法確定是否可用于該病的預(yù)防，迫切需要針對(duì)該病毒的疫苗的相關(guān)研制，防止其對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)造成更嚴(yán)重的損失。

［1］黃瑜，蘇敬良，施少華，等.我國(guó)鴨呼腸孤病毒感染相關(guān)的疫?。跩］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（7）：57-58.

［2］殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1997.

［3］張寶來.鴨源呼腸孤病毒的分離與鑒定［S］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2009.

［4］梁鮮便，韋平.兩起鴨“脾壞死癥”的診斷［J］.廣西畜牧獸醫(yī)，2011，27（2）：89-90.

［5］王劭，陳少鶯，陳仕龍，等.新型鴨呼腸孤病毒NP03株S3基因序列分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，18（3）：567-572.

［6］Liu Qinfang，Zhang Guozhong，Huang Yu，et al.Isolation and characterization of a reovirus causing spleen necrosis in Pekin ducklings［J］.Veterinary Microbiology，2011，148：200-206.

［7］黃瑜，傅光華，施少華，等.新致病型鴨呼腸孤病毒的分離鑒定［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（12）：29-31.

［8］胡小春，胡世君.榮昌某鴨場(chǎng)呼腸孤病毒的分離與鑒定［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，6：121-122.

［9］劉思枷，黃愛芳，鄒永新，等.番鴨呼腸孤病毒病弱毒疫苗的研制［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（7）：36-37.