潘樹(shù)德，李學(xué)儉，張 良，席 東

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體寄生于人和多種動(dòng)物的紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓內(nèi)的一種以紅細(xì)胞壓積降低、血紅蛋白濃度下降和白細(xì)胞增多、貧血、黃疸、發(fā)熱為主要臨床特征的人畜共患傳染病。目前豬的附紅細(xì)胞體病己越來(lái)越引起我國(guó)養(yǎng)豬者的重視。近年來(lái)，我國(guó)豬附紅細(xì)胞體病的發(fā)生和流行呈明顯的上升趨勢(shì)，有些省份為暴發(fā)性流行，尤其是對(duì)仔豬的危害更為嚴(yán)重。

2010年11月，沈陽(yáng)市法庫(kù)縣某養(yǎng)豬戶從外地購(gòu)進(jìn)體重約7.5～20kg，大小不一的仔豬110頭，30 d后同群中較大的豬開(kāi)始發(fā)病，后全群相繼發(fā)病。就診時(shí)已發(fā)病70頭，死亡10頭。

臨床癥狀：病豬精神委頓，被毛粗亂，食欲不振，雙眼無(wú)神，結(jié)膜蒼白、貧血、黃疸明顯；體溫40℃～41.5℃，仔豬開(kāi)始便秘，糞便前期干燥，后排下黃色稀糞，嚴(yán)重時(shí)呈水樣；全身皮膚發(fā)紅，耳尖、腹部、頸部及四肢有紫紅色斑塊，指壓不退色，呼吸急促，流漿性、黏稠鼻液。

病理變化：剖檢病死豬可見(jiàn)全身淋巴結(jié)水腫，切面邊緣出血，斷面呈大理石樣花紋出血；脾臟邊緣有梗死病灶；胃腸道均有不同程度的出血、充血，回盲口附近有輪層狀、紐扣狀潰瘍?cè)?；腎臟表面有針尖大小的出血點(diǎn)；部分膀胱黏膜有出血點(diǎn)；肝臟呈土黃色；膽汁黏稠；肌肉色淡；血液凝固不良。

根據(jù)臨床癥狀和病理變化可初步診斷為豬瘟和附紅細(xì)胞體的混合感染，現(xiàn)對(duì)豬附紅細(xì)胞體的實(shí)驗(yàn)室診斷及該群豬的治療敘述如下。

1 材料與方法

1.1 材料 血液樣品 采自法庫(kù)某農(nóng)戶豬場(chǎng)的病豬。

試劑：吖啶黃、枸櫞酸、堿性品紅、濃鹽酸、瑞氏染液、姬姆薩染液、甲醇、磷酸氫二鈉、偏亞硫酸鉀、活性碳、固綠、吖啶橙等。

主要設(shè)備：OLYMPUS倒置顯微鏡；OLYMPUS熒光顯微鏡；普通光學(xué)顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 取病豬血 豬附紅細(xì)胞體病待檢血液采自自然發(fā)病的附紅細(xì)胞體患豬的靜脈血。

1.2.2 鮮血壓片鏡檢 將1滴靜脈血滴于載玻片上，加等量的生理鹽水稀釋，降低血漿黏度，防止血液中紅細(xì)胞重疊密集，以便觀察。在400倍顯微鏡下找到紅細(xì)胞后，待血液停止流動(dòng)后，即可觀察。

1.2.3 姬姆薩染色 姬姆薩染色液的配制：取姬姆薩染料0.6g，加入50mL甘油內(nèi)，于56℃下加熱2 h，然后加入甲醇50mL，于3～5d后過(guò)濾，即為原液。使用時(shí)與各種pH值的PBS以1∶20的比例混合，即為染色液。

染色：無(wú)菌采取豬靜脈血，與阿氏液1∶1混合。推片、干燥后用甲醇固定，待甲醇揮發(fā)干凈后將玻片浸于不同pH值的染色缸中，每種pH值放4張，并分別于6、12、18、24h后進(jìn)行觀察。

1.2.4 瑞氏染色 瑞氏染色液的配制：取瑞氏染料0.1g置乳缽中，徐徐加入甲醇，研磨以促其溶解。將溶液傾入有色中性玻瓶中，并數(shù)次以甲醇洗滌乳缽，亦傾入瓶?jī)?nèi)，最后使全量為60mL即可。將此瓶置暗處過(guò)夜，次日過(guò)濾即成。

染色：推片自然干燥后，滴加瑞氏染色液，染色3min，然后加等量蒸餾水再染5min，蒸餾水沖洗。

1.2.5 吖啶橙染色 吖啶橙染色液的配制：將0.01g吖啶橙溶于100mL 0.05mol／L，pH值7.5的Tris-HCl緩沖液中。

染色：將涂有標(biāo)本的玻片用甲醇固定，待甲醇揮發(fā)干凈后將玻片置濕盒內(nèi)，加適量吖啶橙染液，37℃、10min。用pH值7.4的PBS輕輕沖洗，溶液分色2min，用PBS洗滌2次，直接在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 治療 對(duì)全群豬進(jìn)行緊急免疫，用脾淋苗加免疫增效劑新必妥1∶1稀釋后每豬肌肉注射2頭份。

全群豬按阿莫西林250mg／kg加土霉素1000 mg／kg拌料連用7d，嚴(yán)重病豬用血蟲(chóng)凈1g，用生理鹽水稀釋成5%濃度，每千克體重10mg，肌肉注射，每日1次，連用2d，隔日再肌肉注射1次。同時(shí)用復(fù)合維生素B和維生素C飲水。飲水中添加黃芪多糖粉和電解質(zhì)。

整個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行徹底消毒。用2%來(lái)蘇兒溶液進(jìn)行帶豬消毒，5%來(lái)蘇兒溶液用于場(chǎng)地、污物、周?chē)h(huán)境消毒。隔日1次，連用1周。

加強(qiáng)飼養(yǎng)管理工作，驅(qū)除蚊、蠅、疥螨、虱等；調(diào)整飼養(yǎng)密度，改善飼養(yǎng)環(huán)境，保持豬舍安靜。及時(shí)隔離病豬，病死豬作無(wú)害化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接血液壓片鏡檢的結(jié)果 光鏡下，可見(jiàn)多數(shù)紅細(xì)胞表面及周?chē)接?～6個(gè)附紅細(xì)胞體。紅細(xì)胞呈淡灰色，附紅細(xì)胞體發(fā)出綠色亮光。附紅細(xì)胞體多數(shù)附著于紅細(xì)胞表面單個(gè)或成團(tuán)寄生，呈鏈狀或鱗片狀。少數(shù)呈點(diǎn)狀位于紅細(xì)胞的邊緣或中央。嚴(yán)重感染病例的每個(gè)紅細(xì)胞上附紅細(xì)胞體可達(dá)20個(gè)以上，此時(shí)紅細(xì)胞在光鏡下猶如突起的蓖麻球和菠蘿狀。附紅細(xì)胞體在血漿中呈游離狀，常做擺動(dòng)、扭轉(zhuǎn)、翻滾、上升、下降等運(yùn)動(dòng)，一旦附著在紅細(xì)胞上以后則停止運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)中以個(gè)體小者顯得最活潑。若將血液存放于4℃冰箱中，72h內(nèi)，血漿中的附紅體及菠蘿狀的紅細(xì)胞增多，經(jīng)56℃水浴1min恢復(fù)至雙凹狀，血液中游離的附紅細(xì)胞體大量增加，運(yùn)動(dòng)活潑，有的跳躍，有的做高 速旋轉(zhuǎn)。如溫度增至60℃時(shí)大部分附紅細(xì)胞體停止運(yùn)動(dòng)，100℃1min全部停止.將含有菠蘿狀紅細(xì)胞的血液在4℃冰箱中存放72h后取出，生理鹽水洗滌3次，56℃水浴1min，將此500r／min離心取上清液，再3000r／min離心30min，棄上清取沉渣，見(jiàn)大量活動(dòng)附紅細(xì)胞體。

2.2 姬姆薩染色鏡檢的結(jié)果 不同pH值染色液對(duì)染色效果的影響，見(jiàn)表1。

表1 不同PH值染色液染色效果

由表1可以看出，在pH值8.0以上的堿性環(huán)境中，姬姆薩染料對(duì)附紅細(xì)胞體的著色效果較好，附紅細(xì)胞體著色較深，并且比較清晰，而在pH值8.0以下的環(huán)境中則著色不好。

染色時(shí)間對(duì)結(jié)果影響：染色6h或12h觀察，整個(gè)血片著色不好，18h以上可獲得滿意效果，即鏡下觀察附紅細(xì)胞體著色深，輪廓分明。姬姆薩染色后在紅細(xì)胞表面上可見(jiàn)到0.5～1.5μm的紫紅色顆粒，呈圓形、逗號(hào)狀，每個(gè)紅細(xì)胞上可出現(xiàn)多個(gè)。

2.3 瑞氏染色結(jié)果 紅細(xì)胞和附紅細(xì)胞體均為藍(lán)紫色，附紅細(xì)胞體著色較深。在星形紅細(xì)胞的突出部位或紅細(xì)胞表面，可見(jiàn)到圓形深染的顆粒狀物，每個(gè)紅細(xì)胞上有3～8個(gè)不等。

2.4 吖啶橙染色 在熒光顯微鏡下紅細(xì)胞為暗淡的綠色，在大多數(shù)紅細(xì)胞邊緣及表面上可看到一些發(fā)亮熒光的小體，直徑1μm左右，為被吖啶橙染色的附紅細(xì)胞體。

2.5 治療結(jié)果 3d后，病情逐漸好轉(zhuǎn)，恢復(fù)食欲；5d后，基本采食；7d后，恢復(fù)正常，疫情得到控制。

3 討論

3.1 血液壓片相襯觀察法 該方法操作程序簡(jiǎn)單，顯微圖像反差強(qiáng)烈，附紅細(xì)胞體呈綠色亮光，容易觀察，檢出率高，在附紅細(xì)胞體數(shù)量較少的情況下，于暗淡的背景中極容易看到發(fā)出綠色亮光的附紅細(xì)胞體。缺點(diǎn)是對(duì)顯微鏡的性能要求較高，普通顯微鏡和性能欠佳的相襯顯微鏡，其觀察效果常不理想。

3.2 瑞氏、姬姆薩染色法 染色程序簡(jiǎn)單，省時(shí)省事，染色標(biāo)本中各種血細(xì)胞及附紅細(xì)胞體的顯微圖像清晰，容易觀察和判定。染色后的血液涂片如經(jīng)脫水、封固可長(zhǎng)期保存，有利于進(jìn)行學(xué)術(shù)交流或作回顧性診斷。缺點(diǎn)是這種染色方法和其他常規(guī)的快速染色法均可產(chǎn)生人為假象（姬姆薩色素沉著），色素會(huì)附著在紅細(xì)胞上，易被誤認(rèn)為附紅細(xì)胞體。經(jīng)姬姆薩染色后，有的正常紅細(xì)胞邊緣也有著色顆粒，無(wú)法與因附著有附紅細(xì)胞體的而出現(xiàn)邊緣著染的病變紅細(xì)胞明顯區(qū)別，而發(fā)生誤判。在附紅細(xì)胞體的數(shù)量較少時(shí)，還容易造成漏判。盡管如此，如果操作得當(dāng)，這些染色法，仍不失為一般實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)診斷較為適用的方法。標(biāo)本以相襯顯微鏡觀察時(shí)，顯微圖像反差強(qiáng)烈，在附紅細(xì)胞體數(shù)量極少的情況下，于暗淡的背景中也極容易看到發(fā)出白色亮光的附紅細(xì)胞體，而做出確切的診斷。

3.3 吖啶橙染色法 該方法屬于熒光染色法的一種，吖啶橙可插入DNA和雙鏈RNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)的堿基對(duì)之間，此染料是堿性熒光探針可與多核苷酸鏈上的酸性磷酸基團(tuán)之間借靜電結(jié)合。因此，它具有特異性強(qiáng)、檢出率高、不易受紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響等特點(diǎn)。即使附紅細(xì)胞體的數(shù)量較少，以常規(guī)染色法難以做出診斷的血液標(biāo)本，使用吖啶橙染色時(shí)，呈現(xiàn)明亮桔黃色的病原也容易與暗綠色的背景區(qū)別開(kāi)來(lái)，從而做出明確診斷。該方法的不足之處是以熒光染料染色的標(biāo)本不易保存，難以作回顧性診斷。

4 小結(jié)

4.1 通過(guò)對(duì)病料直接血液壓片和制作血涂片染色鏡檢，結(jié)果表明，采集的病料感染了附紅細(xì)胞體。

4.2 通過(guò)采取緊急免疫接種、藥物防治、嚴(yán)格消毒和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等方法，3d后，病情逐漸好轉(zhuǎn)，恢復(fù)食欲；5d后，基本采食；7d后，恢復(fù)正常，疫情得到控制。