崔浩然 劉永宏 趙 麗 焦海宏 張志峰 劉俊峰

(塔里木大學動物科學學院/新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾市，843300)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV)引起豬的一種高度接觸性傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均可感染，但以妊娠母豬和1月齡以內的仔豬最易感，該病以母豬的流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬的呼吸困難、敗血癥、高死亡率等為主要特征[1]。

目前，PRRS嚴重威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)和世界公共衛(wèi)生，給經(jīng)濟帶來巨大的損失，僅美國因該病每年至少要花費5.6億美元[2]，權威組織評價每頭生長豬出欄前因PRRS花費5.60美元～7.60美元。

2006年春夏之交，我國從南向北25個以上省、市、自治區(qū)暴發(fā)以高熱、高發(fā)病率、高死亡率和低治愈率為特征的“豬高熱病(porcine high fever disease，PHFD)”，至少200多萬頭豬發(fā)病，死亡40萬頭之多，2007年7月田克恭等及農(nóng)業(yè)部[3]將其確診為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(Highly Pathogenicity Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，HP－PRRS)，JXA1株為HP－PRRSV代表株，屬于美洲型。并將HP－PRRS確定為中國一類動物疫病[3]，普通毒力的PRRS確定為中國二類動物疫病。

PRRSV為單股正鏈RNA病毒，根據(jù)抗原性差異將各地PRRSV分離株分為兩個型，即歐洲型(Ⅰ型)和美洲型(Ⅱ型)，原型株分別為LV株和ATCC VR－2332株[4]。PRRSV基因組全長約15kb，至少編碼9個相互重疊的開放閱讀框架(Open reading frame，ORF)，即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7[5]。ORF5、ORF6和ORF7編碼三個主要的結構蛋白，分別為被膜蛋白GP5、膜蛋白M和核衣殼蛋白N[5]。和歐洲型原型株LV株相比，北美型N蛋白核苷酸同源性僅約63%，氨基酸同源性僅約59%的水平[6]。如此相對高的偏離原因為多個核苷酸置換、插入和缺失引起，使北美型N蛋白比歐洲型LV株少了5個氨基酸[7] 。

考慮新疆南疆周鄰多國的地理位置、戈壁沙漠地域較廣和干旱氣候等特點，以及PRRSV高變異性[7]和抗體依賴性增強[8]等特點，新疆南疆毒株可能有其自身的、不同于國內外其他毒株的特點。本研究擬針對新疆南疆PRRSV ORF7部分因序列進行遺傳演化分析，討論所得毒株類型，為新疆南疆有效防制PRRS提供依據(jù)和技術儲備?，F(xiàn)結果報告如下:

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

采自新疆南疆阿克蘇和庫爾勒地區(qū)發(fā)病自然死亡豬只。陽性對照為上海海利/藍耳病活疫苗/高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(HuN4－F112株)。

1.1.2 主要試劑盒

Trizol invitrogenTM(Code No.:15596－026)，購自Invitrogen生物工程有限公司;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.:DRR019A)，Premix Taq Version2.0(Code No.:D331A)，購自寶生物工程(大連)有限公司;TIANgel Midi Purification Kit(Code No.:DP209)，TIANprep Mini Plasmid Kit(Code No.:DP103)，pGM－T克隆試劑盒(Code No.:VT202)，DNA markerⅡ(Code No.:MD102)，DNA markerⅢ(Code No.:MD103)均購自天根生化科技(北京)有限公司;等。

1.1.3 PRRSV參考毒株

PRRSV參考毒株均下載于NCBI數(shù)據(jù)庫，毒株名稱、大小和GenBank登錄號見表1。

1.1.4 引物

按照引物設計原則，利用Primer Premier5.0分子生物學軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫中保守的PRRSV基因序列為參照設計特異性引物，跨度300bp左右，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。具體序列如下:上游引物:5'－AATGGCCAGCCAGTCAATCA－3';下游引物:5'－GAATCAGGCGCACTGTATGA－3'。

表1 參考毒株

1.1.5 儀器

PCR儀(TC－5000，Bibby scientific Ltd)，小型高速冷凍離心機(R134a，Hermetically sealed refigeration system)，電泳儀(DYY－12，北京市六一儀器廠)，紫外分析儀(JY02S，北京君意東方電泳儀設備有限公司)，等。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

從病死豬肺臟等混合組織中提取總RNA，按Trizol invitrogenTM試劑盒說明書操作。

1.2.2 RT－PCR反應

總RNA按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒，利用自行設計的特異性引物，進行一步法擴增ORF7基因片段，退火溫度54.1℃。設立陽性對照(弱毒疫苗)和陰性對照(蒸餾水)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化回收

取ORF7基因RT－PCR擴增產(chǎn)物電泳切膠后，按照TIANgel Midi Purification Kit試劑盒說明進行回收純化。

1.2.4 純化產(chǎn)物連接T載體

膠回收純化目的產(chǎn)物與pGM－T載體連接，按照pGM－T克隆試劑盒說明操作。

1.2.5 轉化DH5α感受態(tài)細胞、鑒定、搖菌及提取質粒送測序

將連接產(chǎn)物轉化自制的感受態(tài)細胞DH5α，進行藍白斑篩選。白色菌落利用Premix Taq?Version2.0試劑盒進行菌落PCR鑒定，挑取多個PCR陽性菌落搖菌，按照TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒提取質粒DNA，標記為XJNJ－4－1、XJNJ－4－3、XJNJ－5－2、XJNJ－5－3、XJNJ－9－1、XJNJ－9－2、XJNJ－13－1、XJNJ－13－2、XJNJ－14－1、XJNJ－14－3、XJNJ－18－1、XJNJ－18－2、XJNJ－19－2和XJNJ－19－3，送生工生物工程(上海)有限公司測序，測序引物為T7。

1.2.6 序列分析

用DNAMAN和DNAStar生物學軟件進行序列比對和遺傳演化分析。

2 結果與分析

2.1 ORF7基因RT－PCR擴增結果

利用ORF7基因特異性引物，對發(fā)病疑似PRRS豬組織病料總RNA進行RT－PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示，14例PRRSV陽性，分別命名為PRRSV XJNJ－4－1、XJNJ－4－3、XJNJ－5－2、XJNJ－5－3、XJNJ－9－1、XJNJ－9－2、XJNJ－13－1、XJNJ－13－2、XJNJ－14－1、XJNJ－14－3、XJNJ－18－1、XJNJ－18－2、XJNJ－19－2和XJNJ－19－3株，得到的目的基因片段與預期的大小一致，對照成立(圖1)。

圖1 ORF7基因RT－PCR擴增結果

2.2 ORF7基因核苷酸序列比較分析

RT－PCR陽性產(chǎn)物膠回收純化，連接pGM－T載體，轉化自制的感受態(tài)細胞DH5α，白色菌落進行菌落PCR鑒定，挑取PCR陽性菌落搖菌，提取質粒DNA，送生工生物工程(上海)有限公司測序，獲得了14個ORF7基因部分片段序列。

本研究獲得的14個新疆南疆PRRSV毒株與6個國內代表毒株(2006年中國暴發(fā)HP－PRRS代表株JXAl，中國另外一個HP－PRRSV毒株HuN，中國自然弱毒疫苗株R98，JXA1致弱株JXA1 P80和中國代表株CH－1a及其致弱株CH－1R)和3個國外代表株(進口美洲型疫苗株MLV，美洲型代表毒株VR2332和歐洲型代表毒株LV)相應的ORF7基因序列進行序列比對分析，結果顯示本研究獲得的14株、國內6株參考株以及進口美洲型疫苗株MLV和美洲型代表毒株VR2332都不存在9個堿基的缺失，只有歐洲型代表毒株LV該位置有9個堿基的缺失，結果與預期設計相符(圖2)。

圖2 ORF7片段中核苷酸的缺失

2.3 ORF7基因核苷酸序列遺傳進化樹

將本研究獲得的14個PRRSV毒株ORF7基因部分片段，與參考的9株PRRSV截取相應位置長度的ORF7基因序列，進行核苷酸比對，繪制了23個毒株的發(fā)育進化樹。如圖3所示，本研究的14株均與中國代表株CH－1a及其致弱株CH－1R、2006年中國暴發(fā)HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80、中國另外一個高致病性毒株HuN、中國自然弱毒疫苗株R98、進口美洲型疫苗株MLV和美洲型代表毒株VR2332在同一個大的分支，均不與歐洲型代表株LV在一個分支。另外，XJNJ－5－2和XJNJ－5－3株與2006年中國暴發(fā)HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80和中國另外一個高致病性毒株HuN在同一個小的分支內。

3 討論

1996年郭寶清等[9]首次從北京流產(chǎn)胎兒體內分離到PRRSV，從而證實PRRS已在我國存在。隨后，該病在中國各省市相繼均有報道。2006年，中國豬養(yǎng)殖場由南向北暴發(fā)一次毀滅性災難－HPPRRS。中國新疆其他省市對PRRS研究較多，新疆對該病的研究屬于探索階段。新疆地處中國西北邊陲，周邊與8國接壤，尤其在俄羅斯流行PRRSV歐洲型毒株，與中國流行的美洲型毒株有明顯差異。另外，中國臺灣[10]、中國內地檢疫口岸以及內地一些地區(qū)有歐洲型毒株的報道。之前的研究，兩洲分離株屬于兩個不同的基因型，各洲野外分離株和各洲起源株有高度的親緣關系，亞洲國家PRRSV遺傳學關系顯示為美洲型[11]。近年來，PRRSV的流行早已打破原來的地域限制，在亞洲和北美均有歐洲型PRRSV流行的報道，歐洲也出現(xiàn)了野生型PRRSV的美洲株。所以，有必要研究分析清楚新疆南疆PRRSV流行毒株的類型及特點，以便于更好的預防和控制新疆南疆PRRS。對于PRRSV的相關基因的變異性研究是十分必要的，在此基礎上進行合理的種毒株選擇，疫苗設計和制備，以便提出有效的防控措施和防制計劃。

PRRSV的ORF7基因，是除ORF6基因以外保守性最高的編碼結構蛋白的基因[12]，美洲型毒株間氨基酸的同源性為96%～100%，歐洲型毒株間氨基酸同源性為94%～99%，但歐洲型與美洲型毒株之間N蛋白氨基酸的同源性僅為63%，氨基酸同源性僅為59%[6]。本研究針對相對保守的ORF7基因，設計了可以同時擴增歐洲型和美洲型PRRSV毒株ORF7基因部分片段的特異性引物，擴增片段包括歐洲型毒株9個核苷酸片段的缺失區(qū)，針對此用于區(qū)分歐洲型和美洲型毒株。同時，本研究病料均采自新疆南疆發(fā)病疑似PRRS豬只，且均來自未免疫PRRS弱毒疫苗豬場，所以此次陽性結果表明該豬場存在PRRSV感染。本研究通過RT－PCR有14例PRRSV陽性，說明該組織樣品來源豬場存在PRRSV感染。RT－PCR陽性產(chǎn)物克隆測序獲得的14個ORF7基因片段，均沒有該位置9個核苷酸的缺失。同時結合參考的9株PRRSV代表株，截取相應位置長度的ORF7基因序列，進行核苷酸序列比對得到的進化樹顯示，本研究的14株均與中國代表株CH－1a及其致弱株CH－1R、2006年中國暴發(fā)HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80、中國另外一個高致病性毒株HuN、中國自然弱毒疫苗株R98、進口美洲型疫苗株MLV和美洲型代表毒株VR2332在同一個大的分支，均不與歐洲型代表株LV在一個分支。以上結果綜合表明，本研究采集樣品豬場感染了PRRSV美洲型毒株，同時說明這些豬場沒有感染歐洲型毒株。

另外，進化樹顯示XJNJ－5－2和XJNJ－5－3株與2006年中國暴發(fā)HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80和中國另外一個高致病性毒株HuN在同一個小的分支內，因為本研究病料均采自未免疫PRRS弱毒疫苗豬場，所以XJNJ－5－2和XJNJ－5－3株屬于高致病HP－PRRSV毒株

至于更準確的結論，以及新疆南疆更多毒株的獲得及毒株特點分析，會在將來的工作中逐步進行，從采樣點全面、毒株數(shù)量多等方面考慮，最終監(jiān)測新疆南疆PRRSV毒株類型及特點，以便及早的發(fā)現(xiàn)新毒株和新特點，提出更加有效的防制對策，減少因PRRS造成新疆南疆養(yǎng)豬業(yè)損失。

4 結論

本實驗未檢測到歐洲型毒株，獲得的14個新疆南疆地區(qū)PRRSV毒株均屬于美洲型毒株，其中2株屬于美洲型高致病性HP－PRRSV毒株。

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