杜文靜，魏育才，董信芳，崔芬芬，沈世林

(蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000)

近年來，隨著腫瘤發(fā)病率的逐年上升，由于腫瘤的轉(zhuǎn)移及其產(chǎn)生的效應(yīng)嚴(yán)重影響了患者的生存。黃芪及其制劑的抗腫瘤作用，受到醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。研究顯示黃芪輔助化療可抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少毒副反應(yīng)，并可提高機(jī)體免疫功能，改善腫瘤患者的生活質(zhì)量［1］。為了合理使用有限藥用植物資源，了解馬銜山黃芪抗腫瘤轉(zhuǎn)移效果及其作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)就馬銜山黃芪水體取物抗腫瘤轉(zhuǎn)移與生長(zhǎng)進(jìn)行了觀察研究。

1 材料

1.1 瘤株與動(dòng)物

H22肝癌細(xì)胞株，由蘭州大學(xué)藥理學(xué)研究所提供。清潔級(jí)昆明種雄性小鼠60只，體重(20±2)g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):14－005。

1.2 黃芪水提物制備

黃芪200 g購(gòu)于蘭州市，經(jīng)鑒定為馬銜山黃芪(Astragalus mahoschanicus Hand.－Mazz.)。按傳統(tǒng)方法水煎煮3次，合并3次濾液后加熱濃縮制成含生藥量為1 g·mL－1的黃芪水煎液。

1.3 試劑

環(huán)磷酰胺(CTX)，每支 0.2 g，批號(hào) 20100905，山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

取傳代6 d后的H22肝癌小鼠無菌抽取腹水，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞存活率≥95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)mL－1。小鼠60只，每只自尾靜脈注射H22細(xì)胞懸液0.2 mL，建立H22肝癌血道轉(zhuǎn)移模型。隨機(jī)分為6組，分別為NS組、CTX組、馬銜山黃芪低、中、高劑量組以及馬銜山黃芪合并CTX組(簡(jiǎn)稱合并組)。

以正品黃芪15 g的臨床用量作為參照中劑量，按人與小鼠藥物換算方法計(jì)算出小鼠等效劑量。依次為馬銜山黃芪低劑量 0.46 g·kg－1、中劑量2.08 g·kg－1、高劑量為 6.23 g·kg－1［2］。造模 1 d后，馬銜山黃芪組每天給予水體取物灌胃，NS組每天給予生理鹽水0.2 mL·10g－1灌胃，CTX組每天給予CTX 20 mg·kg－1腹腔注射，馬銜山黃芪合并CTX組每天給予馬銜山黃芪水煎液2.08 g·kg－1灌胃以及CTX 20 mg·kg－1腹腔注射。以上均每天1次，共 20 d。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 一般狀況觀察及體重變化

每天觀察并記錄小鼠精神狀態(tài)、皮毛光滑度及活動(dòng)情況等，定期測(cè)量體重，比較實(shí)驗(yàn)前后體重變化。

2.2.2 巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定

治療結(jié)束次日，小鼠腹腔注射2%無菌淀粉溶液1 mL，24 h后再次注射2%無菌淀粉溶液1 mL。1 h后腹腔注射10%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，30 min后處死小鼠取腹腔液涂片。自然晾干甲醇固定1 min后，瑞氏染液染色1 min后用蒸餾水沖洗、晾干。油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

吞噬率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞總數(shù)×100%

吞噬指數(shù)=巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞總數(shù)×100%

2.2.3 脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)測(cè)定

取脾臟和胸腺分別稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾重/體重，胸腺指數(shù)=胸腺重/體重。

2.2.4 肺轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)情況及病理組織學(xué)觀察

摘取小鼠肺臟，稱重;Bouin氏液固定24 h后用無水乙醇漂洗至黃色褪去，以單盲法計(jì)數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)，計(jì)算肺結(jié)節(jié)抑制率、肺轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)指數(shù)以及生長(zhǎng)抑制率。

肺結(jié)節(jié)抑制率=(1－給藥組結(jié)節(jié)數(shù)/造模組結(jié)節(jié)數(shù))×100%

肺轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)指數(shù)=載瘤肺重/體重

生長(zhǎng)抑制率=(1－給藥組轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)指數(shù)/造模組肺轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)指數(shù))×100%

另取部分標(biāo)本，4%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色后光鏡觀察。

2.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般狀況觀察及體重變化

實(shí)驗(yàn)后期，馬銜山黃芪各組小鼠皮毛光滑度以及活動(dòng)情況好于CTX組和NS組，表現(xiàn)為毛發(fā)潤(rùn)澤、善于活動(dòng)、反應(yīng)靈敏。實(shí)驗(yàn)后，各組小鼠體重均有所增加，NS組、合并組、馬銜山黃芪各組增加較為明顯。馬銜山黃芪各組與CTX組比較，體重增加較為明顯(P ＜0.01)。結(jié)果見表1。

表1 馬銜山黃芪對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌(H22)小鼠體重影響()

表1 馬銜山黃芪對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌(H22)小鼠體重影響()

注:與NS組比較aP ＜0.05、bP ＜0.01，與CTX 組比較cP ＜0.05、dP ＜0.01

組別 n 1 d(g) 21 d(g) 體重增幅(g)9 19.56 ±1.08 26.90 ±0.83 7.34 ±0.48 CTX 組 10 20.23 ±0.81 20.45 ±0.73 0.22 ±0.62b合并組 10 19.60 ±0.94 25.16 ±0.52 5.20 ±1.27bd NS組馬銜山黃芪低劑量 10 20.28 ±0.92 26.54 ±0.94 6.26 ±0.78bd 10 20.39 ±0.82 25.95 ±0.94 5.56 ±0.81bd馬銜山黃芪中劑量 10 20.20 ±0.83 25.99 ±1.40 5.79 ±1.27bd馬銜山黃芪高劑量

3.2 對(duì)小鼠胸腺和脾臟質(zhì)量及指數(shù)影響

馬銜山黃芪各組胸腺重量及指數(shù)較CTX組明顯增加(P＜0.05或 P＜0.01)，CTX 組較 NS組有所下降(P＜0.01)。馬銜山黃芪高劑量組的脾臟重量高于CTX組和NS組(P＜0.01)，馬銜山黃芪各組的脾臟指數(shù)明顯高于CTX組和NS組(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)果見表2。

表2 馬銜山黃芪對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌(H22)小鼠胸腺和脾臟質(zhì)量及指數(shù)影響()

表2 馬銜山黃芪對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌(H22)小鼠胸腺和脾臟質(zhì)量及指數(shù)影響()

注:與 NS組比較aP ＜0.05、bP ＜0.01，與 CTX 組比較cP ＜0.05、dP ＜0.01

組別 n脾臟重量(g) 指數(shù)(mg·g－1) 重量(g) 指數(shù)(mg·g－1胸腺)0.09 ±0.01 3.20 ±0.25 0.13 ±0.02 4.28 ±0.63 CTX 組 10 0.06 ±0.01b 2.82 ±0.72 0.11 ±0.02 4.17 ±0.92合并組 10 0.06 ±0.01b 2.23 ±0.32bc 0.11 ±0.01a 4.36 ±0.43馬銜山黃芪低劑量 10 0.09 ±0.01d 3.34 ±0.30c 0.13 ±0.04 5.51 ±0.36ac馬銜山黃芪中劑量 10 0.09 ±0.01d 3.39 ±0.46c 0.13 ±0.02c 5.57 ±0.68bd馬銜山黃芪高劑量 10 0.10 ±0.02d 3.79 ±0.39c 0.16 ±0.02bd 6.62 ±1.01 NS組9 bd

3.3 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能影響

馬銜山黃芪各組巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)均明顯高于NS組和CTX組(P＜0.01)，CTX組吞噬指數(shù)低于NS組(P＜0.05)。結(jié)果見表3。

3.4 對(duì)肺內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移灶抑制及生長(zhǎng)影響

馬銜山黃芪各組、CTX組和合并組的肺重量、瘤結(jié)節(jié)數(shù)，生長(zhǎng)指數(shù)均低于NS組(P＜0.05或P＜0.01)。與CTX組比較，馬銜山黃芪組與合并組的肺重量升高(P＜0.05或P＜0.01)，馬銜山黃芪中、高劑量組和合并組肺內(nèi)瘤結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少(P＜0.01)。結(jié)果見表4。

表3 馬銜山黃芪對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌(H22)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能影響()

表3 馬銜山黃芪對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌(H22)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能影響()

注:與NS組比較aP ＜0.05、bP ＜0.01，與CTX 組比較cP ＜0.05、dP ＜0.01

組別 n 吞噬率(%) 吞噬指數(shù)(%)9 26.22 ±3.11 32.90 ±4.56 CTX 組 10 25.60 ±3.31 27.30 ±3.83a合并組 10 38.20 ±4.76d 40.20 ±5.37bd馬銜山黃芪低劑量 10 50.10 ±2.81bd 57.30 ±3.27bd馬銜山黃芪中劑量 10 57.10 ±5.12bd 67.20 ±6.20bd馬銜山黃芪高劑量 10 67.60 ±4.66bd 76.10 ±3.96 NS組bd

表4 馬銜山黃芪對(duì)小鼠肝癌(H22)轉(zhuǎn)移瘤抑制及生長(zhǎng)影響()

表4 馬銜山黃芪對(duì)小鼠肝癌(H22)轉(zhuǎn)移瘤抑制及生長(zhǎng)影響()

注:與 NS組比較aP ＜0.05、bP ＜0.01，與 CTX 組比較cP ＜0.05、dP ＜0.01

組別 n 肺重量(g)瘤結(jié)節(jié) 肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)(個(gè)) 抑制率(%) 生長(zhǎng)指數(shù)－1×103 生長(zhǎng)抑制率(%)NS組17.289 0.24 ±0.02 26.22 ±4.35 － 8.94 ±0.52 －CTX 組 10 0.15 ±0.04b 13.10 ±3.84b 50.04 7.56 ±1.90a 15.16合并組 10 0.19 ±0.01bc 4.40 ±3.60bbd 83.22 7.58 ±0.30b 15.28馬銜山黃芪低劑量 10 0.21 ±0.02bd 9.80 ±4.52b 62.63 8.06 ±0.75b 9.91馬銜山黃芪中劑量 10 0.20 ±0.02bd 7.50 ±1.58bd 71.40 7.62 ±0.82b 14.79馬銜山黃芪高劑量 10 0.19 ±0.01bc 8.60 ±2.63bd 67.20 7.40 ±0.54b

3.5 肺轉(zhuǎn)移瘤病理組織學(xué)觀察

病理切片鏡下觀察顯示，馬銜山黃芪組，CTX組以及合并組的肺轉(zhuǎn)移程度均低于NS組。NS組肺內(nèi)廣泛分布的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，腫瘤細(xì)胞病理性核分裂相及異型性較明顯。馬銜山黃芪中、高劑量組、CTX組以及合并組的肺組織較為完整，肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶較少，病理性核分裂象少見。馬銜山黃芪組與CTX組比較無明顯差異。見附圖。

圖1 N.S組 腫瘤細(xì)胞彌漫全視野，幾乎浸潤(rùn)肺組織，瘤細(xì)胞核體積異常增大，核漿比接近1∶1，出現(xiàn)雙核甚至多核，病理性核分裂象較多，異型性特別明顯。(×200)

圖2 CTX組 視野內(nèi)腫瘤組織較少，殘存肺組織較多，瘤細(xì)胞異型性較小。(×200)

圖3 合并組 視野內(nèi)腫瘤組織較少，殘存肺組織較多，瘤細(xì)胞異型性較小。(×200)

圖4 THPS低劑量組 腫瘤細(xì)胞異型性不是特別明顯，并可見免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。(×200)

圖5 THPS中劑量組 有較完整肺組織，腫瘤細(xì)胞大小較一致，病理性核分裂象少見，腫瘤細(xì)胞異型性不明顯，視野內(nèi)只能見極少量腫瘤血管。(×100)

圖6 THPS高劑量組 有較完整肺組織，腫瘤細(xì)胞少，呈散在分布，肺組織，腫瘤細(xì)胞少，呈散在分布，象少見，腫瘤細(xì)胞異型性小，視野下無腫瘤血管。(×200)

4 討論

黃芪(Radix Astragali)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫味甘，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、斂瘡生肌、益氣補(bǔ)中等功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)［3－4］黃芪能抗炎、抗氧化和增強(qiáng)免疫功能，具有抗腫瘤作用。正品黃芪來源于豆科黃芪屬蒙古黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)和膜莢黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)的干燥根，由此2種植物所產(chǎn)的黃芪為甘肅產(chǎn)五大宗藥材之一，也是我國(guó)道地藥材黃芪的主要來源。黃芪屬植物在甘肅有13種1變種，在民間均有廣泛地用藥基礎(chǔ)。馬銜山黃芪(A.mahoschanicus Hand.－Mazz.)［5］主要分布在甘肅馬銜山周圍地區(qū)，當(dāng)?shù)刈鳛辄S芪的代用品。近年來由于黃芪野生資源過度采挖和種植方面存在的一系列問題，因此擴(kuò)大藥源和促使資源合理使用很有必要。

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落后，經(jīng)血道運(yùn)行并逃避免疫系統(tǒng)攻擊，到繼發(fā)部位組織粘附，形成克隆并增生生長(zhǎng)［6］。腫瘤的免疫逃逸生物學(xué)特性決定了腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，是患者死亡的主要原因［7］?！罢龤獯鎯?nèi)，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”，腫瘤的轉(zhuǎn)移發(fā)病機(jī)制在中醫(yī)認(rèn)為是由于正氣不足，正不勝邪而邪氣侵犯、走串的結(jié)果，現(xiàn)代研究證實(shí)［8］補(bǔ)氣中藥有較好的抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)在建立小鼠肝癌(H22)細(xì)胞血道轉(zhuǎn)移模型基礎(chǔ)上，采用不同劑量的馬銜山黃芪水提物以及合并CTX進(jìn)行干預(yù)，觀察其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及其生長(zhǎng)狀況。結(jié)果顯示馬銜山黃芪可使小鼠體重增加、促進(jìn)發(fā)育，胸腺、脾臟質(zhì)量升高，巨噬細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)，可見能明顯提高機(jī)體的免疫功能。馬銜山黃芪各組的肺重下降，肺表面瘤結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少，證實(shí)有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和瘤體生長(zhǎng)作用;其中合并組抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力較CTX組明顯，尤以馬銜山黃芪中劑量組抑瘤效果最佳。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)馬銜山黃芪具有良好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移及其抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，為其研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。因此有必要深入研究其有效成分和抗腫瘤機(jī)理，或許能為當(dāng)?shù)剞r(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供一定的支持。

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