姜洪芳，石寶俊，趙伯濤，張衛(wèi)明*

(1.南京師范大學(xué)，江蘇南京 210046;2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京 210042)

香水蓮花(Nymphaea hybrid)是睡蓮科(Nymphaea)睡蓮屬熱帶大型睡蓮，是一種多年生宿根水生花卉，有很高的觀賞價(jià)值。香水蓮花花朵碩大、色彩鮮艷，香氣清雅宜人，集當(dāng)今世界各地荷、蓮珍貴品種之優(yōu)點(diǎn)于一身，因而成為備受青睞的園林水生觀賞花卉。近年來(lái)我國(guó)南方數(shù)省已開始引種，并且發(fā)展到了一定的規(guī)模。源于香水蓮花的各種產(chǎn)品也開始不斷開發(fā)，鮮花可供生食，亦可泡茶、浸酒或隨其他食物燉煮，以子房連同雄蕊一起經(jīng)高溫烘焙制成的香水蓮花茶，也有以其提取物制成的九品蓮花酒等等，均具有一定的保健作用［1－3］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明香水蓮花具有降血脂、抗氧化、抑制酪氨酸酶及預(yù)防酒精肝［4－7］等生物活性，但化學(xué)成分研究相對(duì)較少。

高速逆流色譜(High－speed Countercurrent Chromatography，簡(jiǎn)稱HSCCC)技術(shù)是應(yīng)用兩相互不混溶的溶劑系統(tǒng)在支撐管內(nèi)高速行星運(yùn)動(dòng)的方式下進(jìn)行天然產(chǎn)物的分離純化，因而沒有不可逆吸附，具有樣品無(wú)損失、無(wú)污染、高效、快速和大制備量分離的優(yōu)點(diǎn)。所以，在國(guó)內(nèi)外已被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中活性物質(zhì)的分離純化［8－10］。本文應(yīng)用高速逆流色譜(HSCCC)對(duì)香水蓮花的黃酮類化合物進(jìn)行了純化，經(jīng)鑒定為柚皮素，此化合物為首次從該植物中分離得到，為香水蓮花的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定了化學(xué)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

高速逆流色譜儀:TBE－300A半制備型(上海同田生化技術(shù)有限公司)，TBD－2000紫外檢測(cè)儀，TBP－50A恒流泵，TC－1050恒溫循環(huán)器，聚四氟乙烯(PTFE)管分離柱(內(nèi)徑1.6 mm，分離柱體積280 mL)，N2000色譜工作站和溶劑選擇系統(tǒng)(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司)，進(jìn)樣環(huán)20 mL。

高效液相色譜儀:Agilent 1200 HPLC(美國(guó)安捷倫公司)，G1354A四元泵，G1313A自動(dòng)脫氣機(jī)，G1316柱溫箱，G1315B二極管陣列檢測(cè)器。

HP1100LC－MSD型質(zhì)譜儀;BRUKER AVANCE 500型核磁共振儀;

色譜柱:Ф7.8 cm ×75 cm;

超聲波清洗器:KQ－600DE型 (昆山市超聲儀器有限公司)

薄層層析用硅膠H，柱層析硅膠160～200目，青島海洋化工廠生產(chǎn);

萃取及硅膠柱分離、HSCCC分離用的試劑石油醚、氯仿、甲醇、乙酸乙酯和正己烷均為分析純，高效液相色譜(HPLC)分析用甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

香水蓮花帶雄蕊的干燥花托，浙江省溫州市三心美德投資有限公司提供。七月采摘，剝?nèi)ポ嗥突ò?，貼近花托基部切去花梗，曬干或烘干。經(jīng)鑒定其基原為Nymphaea hybrid。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗提物的制備

稱取70℃干燥2 h的香水蓮花2.74 kg，用75%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取2次，1 h/次，提取液合并濃縮至無(wú)醇味，加入少量的水，離心后得到3個(gè)不同部分:上層為橙黃色油狀物;中間層為橙紅色水溶液;底層為黃色沉淀物，薄層層析檢測(cè)表明底層黃色沉淀物以黃酮類物質(zhì)為主，用乙酸乙酯回流提取3次，回收乙酸乙酯，干物質(zhì)重40 g，作為硅膠柱分離用樣品。

1.2.2 硅膠柱層析分離

稱取160～200目柱層析用硅膠2000 g，干法裝柱(Ф7.8cm ×75cm)。將1.2.1 中得到的樣品以適量醋酸乙酯溶解，硅膠拌樣上柱。以石油醚－乙酸乙酯梯度洗脫，每500 mL為一流分，經(jīng)薄層層析檢測(cè)后合并相同流分，108－112流分經(jīng)鑒別主要為黃酮類化合物，作為高速逆流分離用樣品。

1.2.3 兩相溶劑系統(tǒng)的選擇

對(duì)不同配比的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水組成的溶劑系統(tǒng)進(jìn)行試管實(shí)驗(yàn)，通過分層時(shí)間和上下相體積比粗篩溶劑系統(tǒng)，選取其中的5種配比，用HPLC法分析，計(jì)算目標(biāo)化合物 C的分配系數(shù)K［11－12］。

分別按照 1∶1∶1∶1、1∶1∶2∶1、1∶2∶1.5∶1、1∶1.2∶1.5∶1、1∶1.2∶2∶1這 5 種體積比配制各溶劑系統(tǒng)。分別取相同體積的上相與下相置于試管中，加入一定量的樣品，劇烈振搖使樣品充分溶解，靜置分層。達(dá)到分配平衡后，分別取上相和下相各1.0 mL，揮干溶劑后用等量的甲醇溶解，經(jīng)HPLC分析得到目標(biāo)化合物C在上相中的峰面積(AU)與下相中的峰面積(AL)，按照公式K=AU/AL計(jì)算得到目標(biāo)化合物C的分配系數(shù)。

1.2.4 HSCCC分離用溶劑體系和樣品溶液的配制

用分液漏斗中配制正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(體積比為1∶1.2∶2∶1)兩相溶劑體系，充分振搖后靜置分層。將上相和下相溶液分離后，超聲脫氣20 min，備用，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。

準(zhǔn)確稱取在1.2.2中分離得到的300 mg樣品，溶解于20 mL流動(dòng)相(下相溶液)，過濾后備用。

1.2.5 HSCCC 分離純化方法

將已脫氣的固定相(上相)以10 mL/min的速度泵入HSCCC分離管，待固定相充滿整個(gè)分離管后，開啟循環(huán)水浴并將溫度設(shè)定為25℃。開啟主機(jī)電源，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速為830 r/min，正向旋轉(zhuǎn)，以2 mL/min的流速泵入流動(dòng)相(下相)，待流動(dòng)相從柱出口流出、且固定相不再流出，表明上下相在分離管中達(dá)到平衡后，基線穩(wěn)定后，由進(jìn)樣閥注入20 mL樣品溶液進(jìn)行分離，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各峰組分，HPLC檢測(cè)其純度。分離結(jié)束后，停止轉(zhuǎn)動(dòng)主機(jī)，用無(wú)水乙醇將分離管吹洗干凈。

1.2.6 HPLC分析條件及結(jié)構(gòu)鑒定

HPLC色譜條件:Eclipse XDB－C18分離柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇∶1.0%磷酸 =50∶50，流速為 1.0 mL/min;柱溫為 25 ℃，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)范圍190～400 nm;進(jìn)樣量10 μL。

HSCCC分離得到的組分的結(jié)構(gòu)根據(jù)質(zhì)譜、核磁共振氫譜(1H－NMR)和核磁共振碳譜(13C－NMR)的數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSCCC溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化選擇

溶劑系統(tǒng)是決定HSCCC分離樣品效果的最關(guān)鍵因素。不同的溶劑系統(tǒng)由于黏度、極性和密度等性質(zhì)的差異，對(duì)相同的成分會(huì)產(chǎn)生不同的溶解、分配能力，因而形成分配系數(shù)的差異。根據(jù)色譜理論，利用HSCCC分離樣品的必要條件是目標(biāo)物能穩(wěn)定的溶于兩相溶劑;目標(biāo)物在兩相中具有合適的分配系數(shù)，必須在0.5和2之間。若K遠(yuǎn)小于1，樣品會(huì)很快隨流動(dòng)相流出，達(dá)不到分離效果;若K遠(yuǎn)大于1，樣品的出峰時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，形成寬峰。本研究根據(jù)香水蓮花提取物的目標(biāo)化合物C在不同組成比例的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)，從中優(yōu)選出具有合適分配系數(shù)的溶劑體系，結(jié)果見表1。

表1 化合物C在不同比例的溶劑體系中的分配系數(shù)(K)

由表1可見，在溶劑體系1、3、4條件下，化合物C的分配系數(shù)偏大，在固定相中的保留時(shí)間過長(zhǎng)，不適合分離，而在2的條件下，化合物C易和不被保留的雜質(zhì)幾乎同時(shí)流出而沒有達(dá)到很好的分離，在溶劑體系5中，化合物C的分配系數(shù)接近1，而且所需分離時(shí)間較短，5是較為適宜的HSCCC分離溶劑體系。

2.2 HSCCC檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

化合物C的HPLC－DAD檢測(cè)圖譜(見圖1)可知，由220～230 nm、280～300 nm 2個(gè)較強(qiáng)的的吸收帶組成，320～340nm處的吸收帶為肩峰。雖然色譜峰在225 nm吸收強(qiáng)度大，但由于樣品中的其他化合物及流動(dòng)相(乙酸乙酯、甲醇等)在210～230 nm下均有較強(qiáng)的吸收，在HSCCC分離中這種溶劑吸收帶來(lái)的基線背景吸收值過高，且影響基線的平穩(wěn)。因此，綜合考慮選擇HSCCC分離的檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

圖1 化合物C的HPLC－DAD檢測(cè)圖譜

2.3 HSCCC分離純化結(jié)果

采用1.2.5 節(jié)的條件對(duì) 1.2.2中得到的108－112流分進(jìn)行分離純化，分離時(shí)間為1.5h，固定相保留率為80%。根據(jù)HSCCC圖譜手動(dòng)收集得到3個(gè)組分(見圖2)，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中A、B二峰均為雜質(zhì)峰，C峰較純。將其收集，濃縮干燥，質(zhì)量為80 mg。

圖2 香水蓮花底層黃色物質(zhì)硅膠柱分離108－112流分的HSCCC分離圖

2.4 化合物C高效液相色譜檢測(cè)純度

采用1.2.6節(jié)的條件，對(duì)2.3中的分離產(chǎn)物C峰進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見圖3。使用面積歸一法測(cè)定所得組分的純度為98.6%。

圖3 HSCCC分離所得化合物C的HPLC的色譜圖(290nm)

2.5 化合物C的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物C:白色粉末，分子式C15H12O5，F(xiàn)ABMS m/z:272［M］+，1H－ NMR(500 MHz，Acetone－d6)δ:12.18(1H，s，5－ OH)，9.51(1H，s，4'－ OH)，8.47(1H，s，7－ OH)，7.41(2H，d，J=8.5 Hz，H－2'，6')，6.91(2H，d，J=8.5 Hz，H－ 3'，5')，5.97(1H，d，J=2.1 Hz，H－ 6)，5.96(1H，d，J=2.1Hz，H－8)，5.47(1H，dd，J=12.8 Hz，2.9Hz，H－2)，3.19(1H，dd，J=12.8Hz，17.1Hz，H－3a)，2.75(1H，dd，J=17.1 Hz，2.9Hz，H－ 3b)。13C－ NMR(500 MHz，Acetone－ d6)δ:80.0(C－ 2)，43.6(C－ 3)，197.3(C－4)，165.4(C－5)，96.9(C－6)，167.4(C－7)，95.9(C－8)，164.5(C－9)，130.9(C－1')，129.1(C－2')，116.2(C－3')，158.8(C－4')，116.2(C－5')，129.1(C－6')。從 NMR 可以看出化合物C為黃酮類化合物，1H－NMR顯示B環(huán)為4'一羥基取代(δ 6.91，3'，5'－ H;7.41，2'，6'－ H)，另外A環(huán)還含有2個(gè)酚羥基取代。根據(jù)H－2和H－3的化學(xué)位移及偶合常數(shù)，確定C－2為S構(gòu)型，提示此化合物為二氫黃酮。其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13－15］報(bào)道的(2s)一柚皮素?cái)?shù)據(jù)基本一致，故化合物鑒定為(2s)一柚皮素(naringenin)。

圖4 柚皮素的結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)論

本研究將HSCCC應(yīng)用到香水蓮花黃烷酮類化合物的分離制備，采用正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(1∶1.2∶2∶1，V/V/V/V)四元溶劑系統(tǒng)，香水蓮花粗提物硅膠柱分離流分經(jīng)進(jìn)一步HSCCC分離純化，結(jié)合薄層層析(TLC)和HPLC－DAD光譜，結(jié)果表明:分離得到的化合物C為黃烷酮類化合物，并根據(jù)MS分析及1H－NMR、13C－NMR譜圖分析結(jié)果鑒定為(2s)一柚皮素。所建立的HSCCC分離方法可用于快速、高效、低成本地分離制備香水蓮花中柚皮素對(duì)照品，可為該成分的藥理活性與作用機(jī)制研究以及香水蓮花相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法的完善提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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