唐從國(guó) 郭周慶

如何做好一張HE染色切片

唐從國(guó) 郭周慶

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院病理科，廣東中山528415）

探討常規(guī)染色切片制作過(guò)程的全過(guò)程。重點(diǎn)介紹組織固定、取材、脫水透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片、去蠟、加水、蘇木素染色、分化、返藍(lán)、伊紅染色、封片等各個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)注意的要點(diǎn)，推薦當(dāng)前病理切片的質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。

HE染色；病理切片

HE染色是目前國(guó)內(nèi)外病理診斷上廣泛采用的常規(guī)染色方法。專家們?cè)赋觯骸耙粡埡玫腍E切片是保證正確病理診斷的關(guān)鍵”［1］。切片質(zhì)量的好壞，可直接影響疾病診斷的及時(shí)與準(zhǔn)確性。作為一個(gè)合格的病理技術(shù)人員，能制作出一張高質(zhì)量的HE染色切片，是必須掌握的技術(shù)之一。

1.病理技術(shù)工作者，首先要熱愛本職工作，具有敬業(yè)精神，才會(huì)虛心學(xué)習(xí)，認(rèn)真鉆研。并認(rèn)識(shí)到醫(yī)師的診斷與技術(shù)人員制片的目的是一致的，都是為了病人早日恢復(fù)健康。

2.制片人員要有科學(xué)的態(tài)度，嚴(yán)格的要求和高度的責(zé)任感與熟練的技術(shù)，更要求嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。

3.HE制作的全過(guò)程包括組織固定、取材、脫水、透明、浸蠟、包埋、修整蠟塊、切片、貼片、烤片、去蠟、加水、蘇木素染色、分化、水洗、返藍(lán)、伊紅染色、脫水、透明、封片等十多個(gè)步驟，每一步都必須仔細(xì)操作，即每一環(huán)節(jié)都必須高度重視，才能制作出高質(zhì)量的HE染色切片，就每個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)注意的問(wèn)題闡述于下：

（1）組織固定 固定一定要及時(shí)，組織離體30 min內(nèi)必須固定，且越新鮮固定越好，涂片、刷片、印片等尤其如此。配制固定液時(shí)，稱藥要準(zhǔn)確，p H值調(diào)節(jié)要適當(dāng)，固定液的選擇與濃度的配制均要做好；固定液的用量以多于組織體積的5-10倍為宜。盛固定液的容器，瓶口要大，以防人為的擠壓。由于10%福爾馬林的組織滲透力約為每小時(shí)1 mm，滲入組織的深度約為2-3 mm［2］，故大標(biāo)本要求正中先切開（如肝、脾）；肺則最好用支氣管灌注10%福爾馬林后再浸入固定液內(nèi)、腦及眼球應(yīng)用懸吊法固定。

（2）取材 大小1.5×1.5×0.2-0.3c m，厚度不宜超過(guò)0.5c m，取材整齊、平整、切成方形、圓形或矩形，不要切成三角形，要選取具有代表性的病變組織。內(nèi)窺鏡活檢、診斷性刮宮等碎組織要用紗布包好，再用大頭針扎緊后固定。

（3）脫水 利用梯度酒精逐步脫水，適當(dāng)掌握其濃度與脫水的時(shí)間。加溫脫水可使組織固縮，以室溫脫水為佳；只有脫水徹底，組織才能透明充分，才有利于石蠟的滲入。脫水劑要定期更換，組織塊的周圍脂肪組織不宜過(guò)多，否則將引起脫水不良，難以切片。

（4）透明 一般用二甲苯，小塊組織15-30 min，大塊組織1h即可，透明的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，組織容易變硬、變脆、切不成片，甚至一切就成粉末狀，故要恰當(dāng)?shù)卣莆战M織塊的透明度，正確控制透明的時(shí)間。

（5）浸蠟 先放入熔點(diǎn)低（54-56℃），后浸入熔點(diǎn)高的（58-60℃）石蠟；浸蠟的溫度應(yīng)高于所用石蠟熔點(diǎn)的5℃左右，但最高溫度不宜超過(guò)65℃，小塊組織0.5-1h，大塊組織2-3h，溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，均可使組織收縮、變硬、變脆、切不成片。如能采用低壓真空方法，則浸蠟的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短。

（6）包埋 石蠟包埋的溫度可以比浸蠟的溫度高3-5℃，但動(dòng)作要快，須將組織塊放平整，尤其是兩塊以上的小組織或多塊小組織應(yīng)仔細(xì)地包埋成一條直線與包埋框橫軸平行，這樣既有利于防止病理醫(yī)師診斷時(shí)不小心漏掉一塊小組織同時(shí)也有利于完整地切片，形成蠟帶；更要注意包埋面的解剖組織學(xué)關(guān)系，凡分層次的組織，層次表面應(yīng)向下放平；皮膚可將表皮放在上端，應(yīng)保證各層組織結(jié)構(gòu)都能被觀察到；如果包埋面的方向有錯(cuò)誤，在鏡下就無(wú)法觀察到全層的組織結(jié)構(gòu)，則必然會(huì)造成診斷上的困難。

（7）修整蠟塊 包埋的蠟塊，在冷卻后應(yīng)進(jìn)行修整，組織塊周圍的蠟邊不宜太寬，只需留下約2 mm的空間，以免貼片時(shí)不易被展開。

（8）切片 須備有一臺(tái)優(yōu)質(zhì)的切片機(jī)，切片時(shí)，把固定蠟塊的各個(gè)螺絲旋緊，刀要快，可定期更新一次性刀片，須無(wú)缺口，切3-5μm厚。組織的長(zhǎng)軸應(yīng)與切片刀平行，切片刀應(yīng)先從刀的一端使用，角度4-6°，角度太大會(huì)將切片刮碎，過(guò)小則切不到組織，切片時(shí)將組織切齊全，要求厚薄均勻且形成蠟帶，避免人為損害。蠟塊內(nèi)的被膜應(yīng)放上端，組織的臟層應(yīng)朝下；淋巴瘤或細(xì)菌染色宜薄切，觀察髓鞘神經(jīng)軸索則可切厚些。

（9）貼片 只要載玻片潔凈，切片成帶，攤片箱內(nèi)水溫適當(dāng)（45-50℃），切片就能全面展開。如果展開不平整，可先用30%的酒精初展，然后在攤片箱內(nèi)復(fù)展，這樣一般能得到一張完整漂亮的切片；如果切片有皺褶，可用小鑷子協(xié)助展開，切片可貼在載玻片右側(cè)1／3處，貼平整，一般大組織只貼一塊，小組織可多貼幾塊，但要排列對(duì)稱，整齊美觀。如果攤片箱內(nèi)水溫過(guò)高，蠟片會(huì)融化，組織會(huì)離散；如果攤片箱內(nèi)有組織碎屑或蠟屑，可用紙類貼于水的表面清除，以防止污染切片。

（10）烤片 烤片時(shí)溫度的控制與時(shí)間的把握最為重要，溫度過(guò)高，組織與細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)龜裂；溫度過(guò)低或烤片時(shí)間不足，切下的組織塊容易脫落，一般65℃烤20-30 min，可防止上述現(xiàn)象。

（11）脫蠟、水化，蘇木素染色 染色前，切片須經(jīng)過(guò)兩次二甲苯脫蠟，務(wù)求將石蠟脫盡，再經(jīng)梯度酒精脫苯，最后至水，再入蘇木素液染色。該染液的配置要準(zhǔn)確，染色時(shí)間的控制應(yīng)依據(jù)蘇木素的配方、染液的新舊、季節(jié)、室溫等多種因素綜合考慮，一般情況下染5-15 min；冬天，室溫過(guò)低蘇木素的鉀明礬容易析出，影響染色效果，可加溫染液。

（12）鹽酸分化 染蘇木素后，除胞核著色外，胞漿，間質(zhì)等也不同程度被染上了淡蘭色。分化的目的是讓應(yīng)著色的細(xì)胞核更加清晰，使不應(yīng)著色的部分，盡可能褪盡。分化的時(shí)間要看分化液的濃度，溶液的新舊，組織本身的特性，切片的厚薄及要求著色的深淺等因素酌情來(lái)定，最好是在顯微鏡觀察下控制，一般分化數(shù)秒至30s。分化后的切片應(yīng)立即入水中沖洗，讓組織堿化，使胞核返蘭。應(yīng)注意的是：①入水動(dòng)作要輕；②用細(xì)流水沖洗，請(qǐng)勿直接對(duì)著切片沖洗，以免脫片。③堿化采用自來(lái)水或溫水（30-40℃），讓其自然返蘭并洗凈殘留的鹽酸，有利于切片的長(zhǎng)期保存。如果用碳酸鋰，氨水等弱堿來(lái)返蘭，切片則較易褪色。

（13）伊紅染色 在每100 ml伊紅染液內(nèi)加1滴冰醋酸可起到促染的作用。染色時(shí)間應(yīng)依據(jù)伊紅的配方及染液的新舊來(lái)靈活掌握。伊紅有水溶性及酒精溶性兩種，一般染1-3 min。酒精伊紅著色快，且顏色鮮艷。

（14）完成了蘇木素與伊紅兩種染料的染色，即HE染色，尚須用不同濃度的酒精徹底脫水，再用二甲苯充分透明后，方可用樹膠封片。必須注意的是：①載玻片與蓋玻片均要求潔凈。②樹膠要保持中性，其濃度要適當(dāng)，量要適中，以防樹膠溢出或封固不全。③蓋片周圍多余的，溢出的中性樹膠要擦凈，蓋玻片要放正。封片時(shí)蓋玻片要稍大于組織塊，以保證組織塊已被全部封存在內(nèi)。④蓋片時(shí)動(dòng)作要輕，傾斜角度要適當(dāng)，以免產(chǎn)生氣泡。

討 論

1.應(yīng)該指出的是：從組織的固定，取材，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，染色，封片等一系列的操作均要求制片人員必須具有細(xì)心、耐心和很強(qiáng)的責(zé)任心，要明確任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)了問(wèn)題，都將影響到制片的質(zhì)量，從而影響到醫(yī)師的正確診斷［3］。

2.在制片過(guò)程中，注意①在封片時(shí)，如果見切片呈云霧狀，則說(shuō)明酒精，二甲苯已陳舊，內(nèi)已含有水份，應(yīng)立即更換并重新脫水與透明。②在整個(gè)制片過(guò)程中，不要讓切片完全干燥，以防細(xì)胞固縮，組織龜裂，且影響折光率。③封片以后，不要將切片置入溫箱內(nèi)，因加熱可使樹膠氧化，變?yōu)樗嵝?，促使切片褪色?/p>

3.病理切片的質(zhì)量評(píng)估：北京的梁曉俐2004年曾經(jīng)提出過(guò)兩條標(biāo)準(zhǔn)：一：切片完整，厚4-6μm，厚薄均勻，無(wú)皺褶，無(wú)刀痕。二：細(xì)胞核、質(zhì)染色分明，紅蘭適度，透明，潔凈，封固美觀。最近，廣州的梁英杰，凌啟波等又提出了八條評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)［4］：①切片完整，貼片恰當(dāng)。②切片較薄和均勻，無(wú)污染。③無(wú)皺褶。④無(wú)刀痕。⑤染色清晰，核質(zhì)分明，透明度好。⑥無(wú)固縮、龜裂、‘炭化’胞核。⑦封片適當(dāng)，玻片整潔。⑧字體端正，號(hào)碼清楚。

總之，切片質(zhì)量的穩(wěn)定是一項(xiàng)持之以恒的日常工作。在切片全過(guò)程的每一個(gè)環(huán)節(jié)，如果技術(shù)處理失當(dāng)都必然會(huì)影響診斷的準(zhǔn)確性［5］，病理前輩們?cè)赋觯骸安±韺W(xué)的理論和技術(shù)同樣重要，它被視作一輛車的兩個(gè)車輪，缺一不可，互為依存，互相促進(jìn)，兩者的結(jié)合，決定著病理學(xué)的發(fā)展”［6］。

［1］劉彤華，李維華主編：診斷病理學(xué)，第1版，北京，人民衛(wèi)生出版社，1994，4

［2］唐從國(guó).病理工作者要重視常規(guī)切片的制作.中華醫(yī)學(xué)進(jìn)展雜志，2006，4（3）：72-73

［3］劉樺，盧鶴翔.影響病理切片制作的因素及質(zhì)量控制.中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)院雜志，2005，8（12）：1334

［4］梁英杰，凌啟波，張威.臨床病理學(xué)技術(shù)，第1版，北京，人民衛(wèi)生出版社，2011，80

［5］唐從國(guó).關(guān)于病理技術(shù)處理失當(dāng)問(wèn)題的探討.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2010，19（5）：524-526

［6］梁曉俐.病理學(xué)基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)，第1版，北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院出版社，2004，前言

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10.3870／zgzzhx.2012.04.024

2012-03-30

2012-06-01

唐從國(guó)，男（1971年），漢族，主管技師。