薛銀剛，許 霞，蔡煥興，徐東炯，陳 橋

(1.常州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 常州 213001;2.常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州 213164)

由于形態(tài)學(xué)鑒定的局限性和傳統(tǒng)分類學(xué)家隊(duì)伍的持續(xù)縮減，水生生物分類學(xué)的發(fā)展面臨著幾近沉寂的尷尬［1］。而當(dāng)今世界面臨維持生物物種多樣性、遺傳多樣性和避免流行病發(fā)生等許多嚴(yán)峻問題，都亟需發(fā)展規(guī)范、便捷和廉價(jià)的物種鑒定方法。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，產(chǎn)生了DNA條形碼(DNA Barcoding)技術(shù)。DNA條形碼技術(shù)是分類學(xué)中輔助物種鑒定的新技術(shù)，它代表了生物分類學(xué)研究的新方向，在生態(tài)、環(huán)境、食品等諸多領(lǐng)域都將會(huì)有廣泛的應(yīng)用［2］。

1 DNA條形碼的相關(guān)原理和發(fā)展概況

2003年，HERBERT研究發(fā)現(xiàn)利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基(Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I，COI)基因中一段長度為648 bp的片斷，能夠在DNA水平上成功地區(qū)分物種，并且認(rèn)為利用COI基因從分子演化的角度，將提供一種快速、便宜并且可信的分類方法［3］。這種方法逐步發(fā)展起來并被研究者命名為DNA條形碼技術(shù)?；贒NA條形編碼的分子分類系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類存在的缺陷，使水生生物分類學(xué)再現(xiàn)勃勃生機(jī)，已成為生物分類學(xué)研究中引人注目的新方向和研究熱點(diǎn)［4，5］。

DNA條形碼產(chǎn)生的基礎(chǔ)是現(xiàn)代商品零售業(yè)條形碼編碼系統(tǒng)——Universal Product Code(UPC)。UPC一般使用11個(gè)數(shù)字進(jìn)行排列組合，共有1 011種排列方式，每種排列方式對(duì)應(yīng)一種商品，這樣來區(qū)別各種商品。類似地，在DNA序列中每個(gè)堿基位點(diǎn)有A、T、C、G四種可能的情況，那么只需要15個(gè)堿基位點(diǎn)就能出現(xiàn)415(大于10億)種編碼方式，這個(gè)數(shù)字是現(xiàn)存物種的100倍。

由于蛋白質(zhì)編碼基因密碼子的簡并性，其第三堿基位點(diǎn)通常不受自然選擇的作用而自由變化，因此只要考慮45個(gè)堿基就可以獲得近10億種可選擇的編碼。由于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在實(shí)際研究過程中，要獲得一段幾百個(gè)堿基長度的DNA序列已經(jīng)比較容易，所以根本就沒有必要考慮僅僅45個(gè)堿基長度的DNA序列。DNA條形碼工作可以建立在一段長度為幾百個(gè)堿基的基因DNA序列信息的基礎(chǔ)之上，從理論上講，這些堿基所提供的排列組合數(shù)目完全可以包括所有物種。理想DNA條形碼檢測(cè)到的同屬內(nèi)種間遺傳差異應(yīng)明顯大于種內(nèi)遺傳差異，并在兩者之間形成1個(gè)明顯的間隔區(qū)，稱作Barcoding gap，它是評(píng)價(jià)DNA條形碼理想與否的一個(gè)重要指標(biāo)［6］。

2003年于冷泉港召開的兩個(gè)小型研討會(huì)上，分類學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的專家提出利用特定DNA序列實(shí)現(xiàn)物種鑒定的目標(biāo)。2004年5月由Alfred Sloan基金會(huì)贊助于美國華盛頓特區(qū)舉辦的一個(gè)關(guān)于DNA條形碼的大型研討會(huì)，創(chuàng)立了生命條形碼聯(lián)盟(the Consortium for the Barcode of Life，CBOL)，大部分國家的自然歷史博物館、標(biāo)本館以及研究機(jī)構(gòu)和私人機(jī)構(gòu)等都加入了該組織［7］。2004年秋，美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)與CBOL簽署合作關(guān)系，物種條形碼的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列及其相關(guān)數(shù)據(jù)將存檔于 GenBank。2005年2月，倫敦舉辦了第一屆全球DNA條形碼會(huì)議。大會(huì)對(duì)DNA條形碼的分類概念與思想，實(shí)驗(yàn)技術(shù)的細(xì)節(jié)分析以及資料庫建立等議題進(jìn)行了討論。目前，全球已有多個(gè)針對(duì)不同生物類群開展的項(xiàng)目，最終目的是聯(lián)合各個(gè)類群的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫組建一個(gè)全球生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，此數(shù)據(jù)庫將設(shè)置在公眾可以登陸的DNA序列數(shù)據(jù)庫GenBank中。目前，以線粒體COI基因序列為編碼基礎(chǔ)的生命DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(Barcode of Life Data Systems，BOLD)中，已經(jīng)有超過30萬個(gè)條形碼序列。國際生命條形碼計(jì)劃(International Barcode of Life，IBOL)已經(jīng)在2009年正式開始啟動(dòng)，提出了基于基因片段鑒定生物物種的標(biāo)準(zhǔn)及其實(shí)施框架，中國是IBOL計(jì)劃全球4個(gè)DNA條形碼中心節(jié)點(diǎn)之一(其他3個(gè)為加拿大、美國和歐盟)，主要負(fù)責(zé)亞洲生命條形碼計(jì)劃的實(shí)施，為亞洲其他區(qū)域節(jié)點(diǎn)或國家節(jié)點(diǎn)提供技術(shù)支持與人員培訓(xùn)，并將對(duì)IBOL計(jì)劃未來5年實(shí)現(xiàn)500萬個(gè)國際條形碼序列參照文庫的建設(shè)目標(biāo)發(fā)揮重要作用［8］。

此外，關(guān)于DNA Barcoding的大量研究報(bào)道已見諸于國際重要學(xué)術(shù)期刊上，如 Nature、PNAS等［9］。

2 DNA條形碼的優(yōu)勢(shì)和局限性

DNA條形碼不僅是傳統(tǒng)物種鑒定的強(qiáng)有力補(bǔ)充，更由于它采用數(shù)字化形式，使樣本鑒定過程能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，突破了對(duì)經(jīng)驗(yàn)的過渡依賴，并可利用有機(jī)體的殘片進(jìn)行快速有效的鑒定，能夠在較短時(shí)間內(nèi)建立形成易于利用的應(yīng)用系統(tǒng)。DNA條形碼技術(shù)將極大地促進(jìn)人類監(jiān)測(cè)、了解以及利用生物多樣性的能力，在生命科學(xué)、生態(tài)、環(huán)境、以及醫(yī)藥、食品等諸多領(lǐng)域都將具有廣泛的應(yīng)用前景。

雖然DNA條形碼技術(shù)顯現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢(shì)，但仍然凸顯出一些不足?；趩我痪€粒體COI基因位點(diǎn)的DNA條形碼技術(shù)的局限性與其技術(shù)本身的特點(diǎn)是分不開的，在鑒定不同的物種類群時(shí)需要確定不同的目的基因。在鑒定珊瑚蟲、水母和?？任锓N時(shí)，由于存在線粒體DNA修復(fù)體系，線粒體基因顯然不適合作為條形碼技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)基因。另外，植物的線粒體DNA因雜交和基因滲入而變異很小;真菌線粒體DNA含有內(nèi)含子。對(duì)這些特殊類群的標(biāo)準(zhǔn)條形碼基因的選擇還有待進(jìn)一步研究［10］。

3 DNA條形碼在水生生物分類鑒定中的應(yīng)用

隨著DNA條形碼技術(shù)的推進(jìn)，其在水生生物分類中的應(yīng)用也越來越廣泛。研究表明，DNA條形碼在水生生物包括魚類、甲殼類、軟體動(dòng)物、藻類等分類方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。

3.1 魚類

DNA條形碼在魚類的開發(fā)和應(yīng)用較為廣泛。FISH-BOL組織旨在建立所有魚類將近30 000個(gè)種的魚類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，重點(diǎn)對(duì)15 000種海魚的DNA條形碼數(shù)據(jù)進(jìn)行收集，目前已經(jīng)獲得2 538種魚類的DNA條形碼數(shù)據(jù)。

WARD等對(duì)澳大利亞200多種海洋魚類和北大西洋、地中海和澳大利亞南部海域的15種魚進(jìn)行COI基因的比較，發(fā)現(xiàn)所有物種都能被有效區(qū)分，研究認(rèn)為COI作為海洋魚類的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列是可行的［11，12］。ZEMLAK 等用 COI基因研究了印度洋沿岸35種魚的229個(gè)體，發(fā)現(xiàn)南非和澳大利亞海域的同種魚類存在很大的差異，揭示了大量隱存種的存在［13］。近年來國內(nèi)也有研究報(bào)道指出基于線粒體COI基因能有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)鯉科鲌屬魚類、石首魚科、鯧屬魚類、中國鱭屬、亞東鮭科魚類、澳洲寶石鱸等魚類的分類鑒定［14－19］。

3.2 甲殼類

DNA條形碼在甲殼類動(dòng)物中的應(yīng)用也很廣泛。BUCKLIN等對(duì)40種磷蝦的COI基因進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)DNA條形碼能用于磷蝦類的物種鑒定［20］。RADULOVICI等對(duì)圣勞倫斯河河口和海灣的460種海洋甲殼類進(jìn)行了COI分析，在所研究的507個(gè)個(gè)體中，種間差異比種內(nèi)差異高25倍，95%的個(gè)體序列差異和形態(tài)一致，并發(fā)現(xiàn)4個(gè)種類存在隱存種［21］。麥維軍等對(duì)中國沿海13種對(duì)蝦科動(dòng)物的16S rRNA和COI基因部分序列進(jìn)行了分析，中國沿海對(duì)蝦科6屬13種，形成3個(gè)明顯的分支，這3支分別隸屬新對(duì)蝦屬、仿對(duì)蝦屬和原對(duì)蝦屬［22］。16S rRNA序列可能更適用于對(duì)蝦屬以上階元的遺傳多樣性分析;COI序列更適合對(duì)蝦科種間和群體遺傳多樣性的研究。

3.3 軟體動(dòng)物

目前國際上DNA條形碼技術(shù)對(duì)軟體動(dòng)物的研究還較少，僅在部分物種有報(bào)道。MIKKELSEN等分析了12種雙殼類的COI基因，結(jié)果顯示種內(nèi)差異和種間差異之間沒有重疊，COI可以用于鑒定雙殼類［23］。生活在深海中的帽貝形態(tài)相似、種類繁多，物種鑒定困難，JOHNSON等分析了20個(gè)種類的COI基因，發(fā)現(xiàn)COI能夠區(qū)分大部分姊妹種［24］。律迎春等以COI基因作為DNA條形碼鑒定了海參品種的可行性［25］。沈玉幫等基于線粒體COI序列對(duì)紫貽貝群體遺傳多樣性進(jìn)行研究分析［26］。

3.4 藻類

DNA條形碼技術(shù)在藻類中的開發(fā)和應(yīng)用也已逐漸受到關(guān)注。SAUNDERS等結(jié)合其他紅藻門物種的COI序列，分析了大型紅藻3個(gè)群體的46個(gè)樣品，研究發(fā)現(xiàn)COI能準(zhǔn)確地區(qū)分形態(tài)相似的紅藻，并鑒別新種［27］;LANE 等用 COI、ITS 和 RBCSP基因研究北太平洋褐藻類Alaria屬的54個(gè)樣品，結(jié)果對(duì)于大部分種類，如果僅僅用一個(gè)COI基因片段不能有效鑒別，而3個(gè)基因片段的組合則能有效區(qū)分此類群［28］。

4 問題和展望

水生生物分類目前還主要依賴于形態(tài)學(xué)特征，已無法滿足物種鑒定需求。利用DNA條形碼技術(shù)為分類學(xué)家鑒定新物種提供了一個(gè)契機(jī)，可以大大緩解世界范圍內(nèi)缺乏合格的分類學(xué)家的問題，其在保護(hù)生物學(xué)及生物多樣性調(diào)查等領(lǐng)域有巨大的潛力。

然而，目前DNA條形碼的推廣應(yīng)用也遇到了不少問題，在國內(nèi)利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)水生生物進(jìn)行分類物種鑒定的報(bào)道還較少，主要有如下幾個(gè)原因：

(1)傳統(tǒng)的水生生物分類學(xué)家對(duì)于新興的DNA條形碼技術(shù)持懷疑或否定態(tài)度，思想轉(zhuǎn)變較為緩慢。

(2)國內(nèi)在水生生物DNA條形碼方面的科研項(xiàng)目和資金投入還不夠，從事DNA條形碼的相關(guān)技術(shù)人員還不多。

(3)盡管DNA條形碼技術(shù)能夠準(zhǔn)確的進(jìn)行物種鑒定，但是確立COI基因在物種內(nèi)變異的衡定標(biāo)準(zhǔn)還需要大量的工作。例如，珊瑚蟲、水母和藻類擁有特別的線粒體DNA，不適合作為條形碼的目的基因;植物中COI基因的進(jìn)化速率比動(dòng)物的慢得多，導(dǎo)致用DNA條形編碼來進(jìn)行鑒別困難。

隨著全球氣候變化、人口、生態(tài)環(huán)境、能源和糧食等問題的日益嚴(yán)峻，人類可持續(xù)發(fā)展對(duì)理解和認(rèn)識(shí)生物多樣性的要求日益迫切，物種的準(zhǔn)確和快速鑒定作為對(duì)生物多樣性資源的保護(hù)和持續(xù)利用的基礎(chǔ)，已成為全球性的重大需求。DNA條形碼不僅是傳統(tǒng)物種鑒定的強(qiáng)有力補(bǔ)充，而且可以使標(biāo)本鑒定過程實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，其發(fā)展趨勢(shì)是：

(1)結(jié)合傳統(tǒng)的物種鑒定方法，探索、嘗試新的分子標(biāo)記及多個(gè)分子標(biāo)記(多基因分析法)相結(jié)合來解決COI基因單一化的問題。

(2)DNA條形碼與DNA芯片技術(shù)相結(jié)合，建立高通量、低成本、快速、靈敏、準(zhǔn)確的成套檢測(cè)技術(shù)，通過快速分析一小段DNA分子，可以鑒定出地球上每一個(gè)植物和動(dòng)物物種，如同商場中掃描儀檢測(cè)UPC條形碼的方式一樣快捷。

DNA條形碼技術(shù)將使科研和環(huán)境監(jiān)測(cè)工作更加高效，在中國水生生物分類鑒定中發(fā)揮更大的作用。

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