郭立新，徐 穎，蔡曹盛

（北侖出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 寧波 315800）

啤酒花（Humulus lupulus）又稱酒花、蛇麻花、酵母花等，屬?？贫嗄晟圆荼局参铮侵圃炱【频年P(guān)鍵原料[1]。目前，世界上已報(bào)道的啤酒花類病毒有3種，即：啤酒花潛隱類病毒（Hop latent viroid，HpLVd）、啤酒花矮化類病毒（Hop stunt viroid，HpSVd）和蘋果皺果類病毒（Apple fruit crinkle viroid，AFCVd）[2]，其中啤酒花潛隱類病毒是發(fā)生最普遍的一種潛隱類病毒。

1 分布與危害

啤酒花潛隱類病毒隸屬于Cocadviroid屬，分布于英國(guó)[3-5]、德國(guó)[6]、韓國(guó)[7]、波蘭[8]、日本[9]、捷克[10]、巴西[11]、美國(guó)[2]、中國(guó)新疆[12]等國(guó)家和地區(qū)的啤酒花上。該類病毒侵染啤酒花后不表現(xiàn)明顯的癥狀，但感染Omega品種后出現(xiàn)萎黃、生長(zhǎng)緩慢等現(xiàn)象[3,13~14]。當(dāng)啤酒花受該類病毒侵染后，一些次生代謝產(chǎn)物成分發(fā)生改變，從而影響啤酒花品質(zhì)，降低啤酒花產(chǎn)量。Adams等[4]報(bào)道，不同啤酒花品種受HpLVd侵染后，a-酸的含量降低20%～50%；受HpLVd侵染的啤酒花球果產(chǎn)量降低11%[3]。

2 生物學(xué)特性

啤酒花潛隱類病毒寄主范圍較窄，僅侵染啤酒花（Humulus lupulus）、葎草（Humulus japonicus）和異株蕁麻（Urtica dioica）[2,6]。且該類病毒在啤酒花不同組織中含量有差異，同一植株球果中含量最高，其次是葉片，再次是種子，花粉中含量最少[13,15]。HpLVd沒(méi)有草本寄主植物，黃瓜、西紅柿、菊花（Chrysanthemum）、冬瓜（Benincasa hispida）、紫鵝絨（Gynura aurantiaca）和心葉煙（Nicotiana glutinosa）均不能被啤酒花潛隱類病毒侵染[13]。

HpLVd主要通過(guò)無(wú)性繁殖材料、農(nóng)事操作工具進(jìn)行傳播；也可通過(guò)種子（8%傳毒率）、花粉傳播，但傳毒率很低；至今尚無(wú)昆蟲介體傳播的報(bào)道[4,13,15]。一旦園中啤酒花感染了HpLVd，其傳播速度很快，但其侵染率也因啤酒花品種而異[2]。在捷克種植Osvald’s clone 72品種的啤酒花園植株3 a內(nèi)感染率從零星侵染增至65%[15]；在英國(guó)種植cv.Omega品種的啤酒花園植株2 a內(nèi)受侵染率從個(gè)別感病增至75%，而種植cv.Wye Northdown品種的園中啤酒花受侵染卻較少[4]。HpLVd在啤酒花體內(nèi)的含量還與種植地區(qū)和季節(jié)等有很大關(guān)系[2]。在英國(guó)春末啤酒花中HpLVd含量較高[16]；在德國(guó)，夏季HpLVd含量相對(duì)有所下降[6]。

3 基因組結(jié)構(gòu)與序列分析

啤酒花潛隱類病毒的基因組為一條環(huán)狀單鏈RNA，長(zhǎng) 256 nt，具有 5 個(gè)功能區(qū)，即：左手區(qū)（TL）、致病區(qū)（P）、中央保守區(qū)（C）、可變區(qū)（V）和右手末端區(qū)（TR），形成穩(wěn)定的桿狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)不對(duì)稱滾環(huán)模式進(jìn)行復(fù)制，基因組不編碼蛋白質(zhì)[13,17]。

目前，已報(bào)道啤酒花潛隱類病毒24個(gè)分離物核苷酸的全序列，這些序列之間高度同源，同源性達(dá)97.3%～100%。Matoussek等[18]研究表明，受 HpLVd侵染的啤酒花在正常栽培條件下生長(zhǎng)，啤酒花潛隱類病毒基因序列不易發(fā)生變異，但環(huán)境改變可加劇啤酒花潛隱類病毒核苷酸變異，將受HpLVd侵染的啤酒花植株進(jìn)行熱處理，雖然導(dǎo)致了類病毒濃度降低，卻增加了很強(qiáng)的序列變異。

4 檢測(cè)方法

由于啤酒花潛隱類病毒不編碼任何蛋白，因此不能利用免疫學(xué)（血清學(xué)），如酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）的方法來(lái)檢測(cè)；又因HpLVd至今尚無(wú)指示植物，故不能通過(guò)生物學(xué)方法來(lái)檢測(cè)。迄今為止，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)啤酒花潛隱類病毒的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳法[9,13]、核酸雜交法[9,15]和基于RT-PCR的分子生物學(xué)檢測(cè)方法[2,9,12,15,19]。

4.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是一種基于類病毒RNA分子的特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)的方法。該方法檢測(cè)啤酒花潛隱類病毒常用的有兩種，即：二維電泳和往返雙向電泳[20-21]。

4.1.1 二維聚丙烯酰胺凝膠電泳法 二維電泳（2-Dimensional-PAGE）一次只能對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)[20]。Hataya T等利用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)啤酒花品種VF-cv.Kirin II進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示檢測(cè)到類病毒條帶[9]。

4.1.2 往返雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法 往返雙向電泳（Return-PAGE）方法一次可對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)[21]。Holger P等對(duì)8個(gè)不同品種的啤酒花樣品和2個(gè)接種HpSVd的西紅柿樣品進(jìn)行往返雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其中有2個(gè)品種的啤酒花樣品未檢測(cè)到類病毒條帶，另外6個(gè)品種的啤酒花樣品均檢測(cè)到不同于HpSVd的環(huán)狀RNA條帶[13]。

二維電泳與往返雙向電泳能檢測(cè)出一種病原物是否為類病毒，且該方法是唯一一種不需要知道類病毒核酸序列就可以進(jìn)行檢測(cè)的方法。

4.2 核酸雜交法

核酸雜交方法（Molecular hybridization）是一種分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用于檢測(cè)DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）[22]。啤酒花潛隱類病毒的核酸雜交法有：斑點(diǎn)雜交（Dot blot hybridization）、Northern印跡雜交（Northern blot hybridization）等方法。

4.2.1 斑點(diǎn)雜交法 目前cRNA探針和cDNA探針及合成的寡核甘酸探針已被應(yīng)用于類病毒的檢測(cè)[22]。Hataya T等應(yīng)用HpLVd cDNA探針對(duì)日本采集的啤酒花樣品進(jìn)行斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，日本啤酒花已受到HpLVd的侵染[9]。Matousek J[23]通過(guò)斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢測(cè)接種熱突變HpLVd的西紅柿不同組織中啤酒花潛隱類病毒的含量，結(jié)果顯示，頂部葉片中HpLVd含量最高。Liu S等[12]應(yīng)用生物素標(biāo)記的HpLVd cDNA探針對(duì)新疆采集的啤酒花樣品進(jìn)行了斑點(diǎn)雜交檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各個(gè)采集地的啤酒花均受到了HpLVd的侵染。斑點(diǎn)雜交方法檢測(cè)啤酒花潛隱類病毒具有準(zhǔn)確、特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)，適合于大批量樣品檢測(cè)。

4.2.2 Northern印跡雜交 Northern印跡雜交是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。Holger P等[13]應(yīng)用Northern印跡雜交技術(shù)對(duì)啤酒花樣品進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在55℃條件下放射性HpLVd cRNA探針能與樣品中的啤酒花潛隱類病毒核酸成功雜交，而75℃條件下雜交卻失敗，而放射性HpSVd cRNA探針在55℃和75℃時(shí)均能成功雜交。捷克學(xué)者Jaroslav M等[24]利用Northern印跡雜交技術(shù)對(duì)啤酒花花粉進(jìn)行了HpLVd的成功檢測(cè)。

核酸雜交靈敏度較高，忠實(shí)性強(qiáng)，一次可對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)，但需要有特異性探針。非放射性探針的使用克服了放射性探針存在的如半衰期、安全性、放射性廢棄物處理和操作不便等固有的缺陷。用靈敏的熒光底物代替顯色底物，尼龍膜代替硝酸纖維素膜，可以提高非放射性檢測(cè)的靈敏度。使用cRNA探針的信號(hào)/背景比cDNA探針要好，說(shuō)明cRNA探針有較高的靈敏度[25-27]。

4.3 基于RT-PCR的分子生物學(xué)檢測(cè)法

目前，檢測(cè)與鑒定啤酒花潛隱類病毒基于RTPCR的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、二重 RT-PCR（multiplex RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)。

4.3.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)已廣泛用于啤酒花類病毒的檢測(cè)。國(guó)外，Hataya T等應(yīng)用RT-PCR法和斑點(diǎn)雜交法同時(shí)對(duì)日本采集的啤酒花樣品進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，RT-PCR方法比斑點(diǎn)雜交方法更加靈敏[9]。Matousek等[15]設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，研究建立了啤酒花潛隱類病毒的RT-PCR檢測(cè)方法，并應(yīng)用該方法對(duì)啤酒花種子及雜交苗等進(jìn)行了成功檢測(cè)。我國(guó)Liu等[12]對(duì)新疆7個(gè)不同地區(qū)采集的16份啤酒花樣品進(jìn)行了HpLVd的成功檢測(cè)。該方法檢測(cè)靈敏度高，專一性強(qiáng)。

4.3.2 二重RT-PCR 二重RT-PCR基本原理與常規(guī)RT-PCR相同，區(qū)別是在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)引物，同時(shí)在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增出一條以上的目的DNA片段[28]。Eastwell K C等[2]應(yīng)用二重RT-PCR方法對(duì)美國(guó)華盛頓采集的啤酒花樣品進(jìn)行了HpLVd和HpSVd的同時(shí)檢測(cè)，擴(kuò)增到大小為256 bp和300 bp的兩條目的條帶。此方法相對(duì)于單重RT-PCR而言，更加經(jīng)濟(jì)、快速，但對(duì)引物的設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格。

4.3.3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法 利用TaqMan探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)是在常規(guī)RTPCR反應(yīng)體系中添加1條TaqMan探針，從而使熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步[29－30]。郭立新等[19]根據(jù)HpLVd的保守基因序列，設(shè)計(jì)了引物和TaqMan-MGB探針，并利用該引物和探針對(duì)新疆采集的啤酒花樣品進(jìn)行了啤酒花潛隱類病毒的成功檢測(cè)。

迄今為止啤酒花潛隱類病毒的檢測(cè)方法已從聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)法過(guò)渡到核酸雜交方法，再進(jìn)一步發(fā)展為RT-PCR等方法。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、靈敏度較低，且不能明確知道是哪種類病毒。核酸雜交法的前提是要制備探針，較為復(fù)雜，且檢測(cè)步驟繁瑣。RT-PCR及二重RT-PCR技術(shù)雖然簡(jiǎn)單易行，但需進(jìn)行PCR后處理，易發(fā)生交叉污染，造成假陽(yáng)性現(xiàn)象。實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法利用熒光探針實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目的基因的擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)RT-PCR擴(kuò)增與探針檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程完全閉管，不需PCR后處理，是檢測(cè)HpLVd最靈敏、準(zhǔn)確與快速的方法。

5 防治與控制

由于啤酒花主要通過(guò)根插或根（狀）莖進(jìn)行無(wú)性繁殖[2]，且HpLVd侵染植株不表現(xiàn)明顯癥狀，故感染了啤酒花潛隱類病毒的母本植株僅憑肉眼觀察癥狀、未經(jīng)分析檢測(cè)作為繁殖材料，造成了該類病毒在世界各地廣泛傳播[13]。目前一些學(xué)者已進(jìn)行了脫毒研究，并發(fā)現(xiàn)分生組織培養(yǎng)[9]、溫?zé)岑煼╗31]及冷處理[16]能有效降低啤酒花中HpLVd含量。Hataya T等[9]對(duì)受HpLVd侵染的啤酒花進(jìn)行分生組織培養(yǎng)，獲得2個(gè)無(wú)類病毒的無(wú)性繁殖材料。Matousek J等研究表明，熱處理能降低啤酒花中HpLVd含量，將啤酒花保持35℃培養(yǎng)2周，其體內(nèi)HpLVd含量下降70%～90%[18,31]。ADAMS A N等[32]將侵染HpLVd的啤酒花在黑暗條件下保持2~4℃培養(yǎng)幾個(gè)月后再進(jìn)行分生組織培養(yǎng)，可獲得無(wú)HpLVd的植株。啤酒花潛隱類病毒可通過(guò)農(nóng)事操作工具進(jìn)行傳播，在農(nóng)事操作時(shí)應(yīng)使用化學(xué)藥劑對(duì)工具、機(jī)械進(jìn)行消毒，盡可能防止交叉感染[15]。

6 結(jié)束語(yǔ)

筆者較為系統(tǒng)地綜述了啤酒花潛隱類病毒的分布與危害、生物學(xué)特性、基因組結(jié)構(gòu)與序列分析、檢測(cè)方法及預(yù)防與控制等方面的研究進(jìn)展。明確了HpLVd是一種流行范圍廣、難以防治、對(duì)啤酒花生產(chǎn)造成一定經(jīng)濟(jì)損失的潛隱類病毒。清楚了解了其基因組及核苷酸序列之間的同源性。同時(shí)，本文還分析了當(dāng)前檢測(cè)HpLVd的聚丙烯酰胺凝膠電泳法、核酸雜交法、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、二重RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)等各種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并認(rèn)為實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)效果最好。最后，概述了防治與控制啤酒花潛隱類病毒的關(guān)鍵是對(duì)母本植株進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，使用無(wú)毒繁殖材料。農(nóng)事操作時(shí)使用化學(xué)藥劑對(duì)工具、機(jī)械進(jìn)行消毒，盡可能防止交叉感染。

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