易思榮，肖 波，黃 婭，全 健，韓 風(fēng)，韋中強(qiáng)，曹厚強(qiáng)

（重慶市藥物種植研究所，重慶 408435）

銀杉（Cathaya argyrophylla）是我國(guó)特有的第三紀(jì)孑遺植物。遠(yuǎn)在第三紀(jì)銀杉的家族廣布于北半球的歐亞大陸，在第四紀(jì)發(fā)生的冰川襲擊下，銀杉才在地球上幾乎絕跡，僅在中國(guó)亞熱帶山地的局部地區(qū)有零星殘存。迄今為止，天然銀杉林已在廣西、重慶、貴州和湖南4省區(qū)發(fā)現(xiàn)有分布，基本上間斷分布于大婁山、越城嶺、八面山和大瑤山，其垂直分布幅度較大，最低分布線為海拔920m，最高分布線達(dá)1 840m。但高于1 m的銀杉個(gè)體總數(shù)不超過(guò)5 000棵[1]。

銀杉起源古老，形態(tài)特別，對(duì)裸子植物中松科的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化的研究，以及古生物、古氣候、古地質(zhì)和古生態(tài)方面的研究都有重要的科學(xué)價(jià)值，被公認(rèn)為當(dāng)今世界最珍貴的植物之一，為我國(guó)國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。銀杉作為一種瀕危植物，自1955年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，即引起了國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)者的廣泛關(guān)注和重視，在許多方面的研究都取得了重要進(jìn)展。近年來(lái)，隨著對(duì)生物多樣性保護(hù)的高度重視和保護(hù)生物學(xué)學(xué)科的迅速發(fā)展，銀杉再次受到世人的關(guān)注，銀杉種群的瀕危機(jī)制、種群退化和未來(lái)命運(yùn)成為研究熱點(diǎn)。本文在了解銀杉種群退化的前提條件下致力于對(duì)金佛山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)分布的銀杉的根際微生物開展初步研究，以期掌握銀杉根際微生物的主要類群及其動(dòng)態(tài)變化概況。

1 研究地區(qū)概況

金佛山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于重慶市南部南川市境內(nèi)（東經(jīng) 106°54′～107°27′，北緯 28°46′～29°38′），東接貴州省道真縣，南鄰貴州省正安縣、桐梓縣，西連萬(wàn)盛區(qū)、綦江縣、巴南區(qū)，北與涪陵接壤，最高點(diǎn)為風(fēng)吹嶺，海拔2 251 m，最低點(diǎn)在騎龍鄉(xiāng)柏林的魚跳巖，海拔340m，相對(duì)高差1 911m，面積約1 300 km2。金佛山屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū)，全年氣候溫和，四季分明，雨量充沛，既無(wú)嚴(yán)寒，又無(wú)酷署，立體氣候明顯。年平均氣溫8.3℃，極端低溫-14.4℃，極端高溫29.2℃，年平均降水量1 395.5 mm，平均年日照時(shí)數(shù)1 079.4 h。平均年≥10℃的活動(dòng)積溫 5 435℃，相對(duì)濕度90%。金佛山屬貴州大婁山東段的一條支脈，形成于燕山運(yùn)動(dòng)后期，其后又受到喜馬拉雅造山運(yùn)動(dòng)的影響，在長(zhǎng)期的內(nèi)外應(yīng)力的作用下，形成了深溝峽谷、峭壁懸崖和無(wú)數(shù)大斷層，山體主要由灰?guī)r和石灰?guī)r組成，局部地區(qū)分布有玄武巖、頁(yè)巖、砂巖及變質(zhì)巖等，主要土壤類型有黃壤、黃棕壤及少量亞高山草甸土[2-4]。

金佛山屬于中國(guó)－日本森林植物亞區(qū)的華中地區(qū)，位于我國(guó)三大特有現(xiàn)象中心之一的鄂西—川東植物分布中心，從地理位置分析，它不僅位于東西植物分布的交界地帶，也處于南北植物分界的邊緣地區(qū)，是眾多野生植物的自然分化中心或分布中心[5-6]；另外由于金佛山處于亞熱帶濕潤(rùn)氣候區(qū)，長(zhǎng)期受太平洋濕潤(rùn)季風(fēng)氣候的影響，生物氣候條件十分優(yōu)越，再加之第四紀(jì)冰川運(yùn)動(dòng)時(shí)受到的影響很小，使部分亞熱帶珍稀瀕危植物得到保存、繁衍和發(fā)展，故區(qū)內(nèi)植物種類繁多，類型復(fù)雜多樣，形態(tài)特征各異，不同地質(zhì)年代的植物和不同區(qū)系成分的植物常?；旌显谝粋€(gè)植物群落里，珍稀、孑遺植物也相當(dāng)豐富，是我國(guó)不可多得的中亞熱帶植物集中分布中心。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

根據(jù)金佛山自然保護(hù)區(qū)內(nèi)銀杉分布區(qū)的地形地貌、海拔高度、自然植被等特征，選擇6處有代表性的取樣點(diǎn)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)樣地。在各標(biāo)準(zhǔn)樣地內(nèi)選擇標(biāo)準(zhǔn)木3株，在標(biāo)準(zhǔn)木下挖出表層（0～20 cm）細(xì)根（<5 mm），作為獲取根際土壤的材料，同時(shí)按S形在各標(biāo)準(zhǔn)樣地內(nèi)布點(diǎn)（3～5點(diǎn)），取0～20 cm非根際土壤。將采集的土樣放入已消毒的紙袋，封口并放入消毒密閉的塑料袋，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行檢測(cè)和微生物的分離培養(yǎng)。采樣時(shí)間分別為3月13日、6月20日、9月18日和12月17日。

2.2 樣品處理

稱取一定量的銀杉根條，置于裝有定量無(wú)菌水的容器中，振蕩15～20min，洗下的土壤溶液即為根際土壤懸液。用無(wú)菌鑷子取出銀杉根條，用濾紙吸干表面水分稱重，即可計(jì)算出根際土壤的重量。稱取一定量的非根際土，置于裝有定量無(wú)菌水的容器中，振蕩15～20 min制成非根際土懸液。從野外采集回來(lái)未能及時(shí)處理的土壤樣品保存于4℃冰箱中。

2.3 土壤pH值和含水量測(cè)定

將采集回來(lái)的土樣與水按照一定的比例混合后用精密pH計(jì)測(cè)定土壤pH值。稱取定量的新鮮土壤置于金屬容器稱量，在恒溫烘箱中烘干至恒重后稱重，計(jì)算土壤含水量。

2.4 菌株的分離和培養(yǎng)

采用稀釋平板法分別測(cè)定不同取樣點(diǎn)銀杉根際土懸液和非根際土懸液的細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量。真菌采用PSA培養(yǎng)基，細(xì)菌采用NA培養(yǎng)基，放線菌采用改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基。各土壤溶液分別取100μL置于PDA培養(yǎng)基平板中央，并使用無(wú)菌玻璃棒均勻涂布，然后在不同條件下培養(yǎng)。細(xì)菌置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d后計(jì)數(shù)，真菌置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d后計(jì)數(shù)，放線菌置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～7 d后計(jì)數(shù)。再將獲得的菌株進(jìn)行分離、純化和編號(hào)，并接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，置于4℃條件下保存，用于分類鑒定。

2.5 土壤微生物種群數(shù)量測(cè)定與分類鑒定

細(xì)菌、放線菌和真菌的活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基分別為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，具體培養(yǎng)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]，并采用CFU（Colony Forming Unit）法進(jìn)行計(jì)數(shù)。優(yōu)勢(shì)菌株的分類鑒定遵循以生理生化特征為主，以形態(tài)結(jié)構(gòu)、菌落特征為輔的原則，依據(jù)經(jīng)典的分類方法[8-10]進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤pH值和含水量檢測(cè)

不同季節(jié)采集回來(lái)的土樣需要及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，將其與水按照1:5的比例混合后用精密pH計(jì)測(cè)定土壤的pH值。另稱取各新鮮土樣10.0 g放入金屬容器中稱重，再置于恒溫烘箱中烘干至恒重后稱重，計(jì)算出土壤含水量。結(jié)果表明春、夏、秋、冬四季銀杉林地土壤的pH值分別為6.74、6.93、7.03和6.83，土壤的含水量分別為 16.33%、12.23%、10.76%和14.56%。

3.2 根際微生物數(shù)量和組成

經(jīng)過(guò)培養(yǎng)分離和鑒定，銀杉根際微生物中細(xì)菌、放線菌及真菌的數(shù)量分別細(xì)菌7.35×105cfu/g、放線菌 7.65×104cfu/g、真菌 1.11×104cfu/g，分別占根際微生物總量的89.35%、9.30%和1.35%，其中細(xì)菌的數(shù)量最多，放線菌次之，真菌的數(shù)量最少，與其他物種的根際微生物的分布規(guī)律相符合。表明細(xì)菌在促進(jìn)土壤C、N、P等元素的轉(zhuǎn)化及維持生態(tài)平衡等方面發(fā)揮主導(dǎo)作用。

3.3 細(xì)菌的初步鑒定結(jié)果

從不同季節(jié)的銀杉根際土壤中分離到的細(xì)菌總計(jì)4個(gè)屬，共計(jì)14株。其中，芽孢桿菌屬（Bacillus）8 株、假單胞菌屬（Pseudomonas）3株、微球菌屬（Micrococcus）2株、土壤桿菌屬（Agrobacterium）1株，分別占細(xì)菌總株數(shù)的57.14%、21.43%、14.29%和7.14%。土壤中芽孢型細(xì)菌的主要類群有巨大芽孢桿菌（B.megaterium）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、蠟質(zhì)芽孢桿菌（B.cereus）等。

3.4 放線菌的初步鑒定結(jié)果

從不同季節(jié)的銀杉根際土壤中分離到的放線菌分屬2個(gè)屬，共計(jì)12株。其中，鏈霉菌屬（Streptomyces）菌株有8株，分屬3個(gè)種，即微白鏈霉菌（S.albidus）4 株、綠黃鏈霉菌（S.viridoflavus）3 株、灰色鏈霉菌（S.griseus）1株，鏈霉菌屬占總株數(shù)的92.31%；諾卡氏菌屬（Nocardia）有1株，為綠色諾卡氏菌（N.viridis），諾卡氏菌屬占總株數(shù)的7.69%。

3.5 真菌的初步鑒定結(jié)果

從秋季樟子松根際土壤中分離到的真菌分屬3個(gè)屬，共計(jì)10株。其中青霉屬（Penicillium）有5株，木霉屬（Trichoderma）3株，毛霉屬（Mucor）有 2株，分別占分離到的真菌總菌株數(shù)的50%、30%和20%。

4 小結(jié)與討論

4.1 主要結(jié)果

通過(guò)對(duì)不同季節(jié)采集回來(lái)的銀杉根際土樣分析檢測(cè)，春、夏、秋、冬四季銀杉林地土壤的pH值分別為6.74、6.93、7.03和6.83，土壤的含水量分別為16.33%、12.23%、10.76%和14.56%。

通過(guò)對(duì)銀杉根際微生物的分離培養(yǎng)和鑒定，銀杉的根際微生物中細(xì)菌、放線菌及真菌的數(shù)量分別細(xì)菌 7.35×105cfu/g、放線菌 7.65×104cfu/g、真菌1.11×104cfu/g，分別占根際微生物總量的89.35%、9.30%和1.35%。

其中細(xì)菌總計(jì)4個(gè)屬，包括芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、微球菌屬和土壤桿菌屬，放線菌有鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬，真菌有青霉屬、木霉屬和毛霉屬。

4.2 前期研究結(jié)果

前期研究中，針對(duì)銀杉的根際微生物研究報(bào)道極少，僅邢樹堂等[11]報(bào)道了銀杉外生菌根的觀察方法，且試驗(yàn)材料為銀杉的種子，隨后趙穎茹[12]對(duì)廣西花坪自然保護(hù)區(qū)的兩株銀杉開展了根際土壤真菌的分離與鑒定，而其他研究中主要集中于群落結(jié)構(gòu)與生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律等方面[1,13-15]。

韓艷潔[16]對(duì)內(nèi)蒙古大青山的幾種喬木樹種人工林的根際微生物的數(shù)量和動(dòng)態(tài)分布情況予以了報(bào)道，結(jié)果表明人工油松林、人工落葉松林和天然次生白樺山楊林的根際微生物的數(shù)量等級(jí)均達(dá)到了107cfu/g以上；高明華等[17]從樟子松根際土壤中分離到細(xì)菌6屬、放線菌2屬、真菌3屬，研究結(jié)果表明各類群根際微生物數(shù)量均有明顯的季節(jié)變化。其他針對(duì)松科植物根際微生物的研究未見(jiàn)報(bào)道。

4.3 討論

研究結(jié)果表明銀杉根際微生物中細(xì)菌在數(shù)量基本上比放線菌和真菌高1個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明在微生物總體數(shù)量上細(xì)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，銀杉的根際微生物在數(shù)量上至少較其他松科植物低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)不論從類群數(shù)量還是個(gè)體數(shù)量上，銀杉的根際微生物總量都不及其他松科植物豐富。

前期研究結(jié)果表明，細(xì)菌有利于促進(jìn)土壤中有機(jī)殘?bào)w的分解和潛在養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，提高土壤的供肥能力，釋放出的CO2可供植物進(jìn)行光合作用[18]。根際微生物種類和數(shù)量越大，土壤微生物的活性越強(qiáng)，越能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。另外土壤中的細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能影響其他土壤微生物的生長(zhǎng)，從而直接影響了土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[19]。由此筆者推測(cè)目前各地普遍存在的銀杉種群退化、個(gè)體生長(zhǎng)緩慢、種子自然萌發(fā)率低和成苗率低等現(xiàn)象，極有可能與銀杉的根際微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此有必要在這方面開展更加深入的研究。

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