王秋悅，鄒亞學(xué)，唐家明，李素芬*

(河北科技師范學(xué)院1動(dòng)物科技學(xué)院，2生命科技學(xué)院，河北 秦 皇島，066600)

活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)被認(rèn)為是許多疾病如衰老、動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)壞死等的致病因子。另外，ROS通過誘導(dǎo)DNA損傷、誘發(fā)腫瘤形成和刺激細(xì)胞增殖在腫瘤形成中發(fā)揮作用。為預(yù)防ROS誘發(fā)的損傷，細(xì)胞中含有由ROS代謝酶和ROS中和分子組成的抗氧化系統(tǒng)。通過催化超氧離子自由基(O－2)分解為過氧化氫(H2O2)和氧(O2)，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)為機(jī)體提供了清除正常代謝過程或氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的O－2的第一道防線［1］。在真核生物體內(nèi)有3種SOD:存在于線粒體基質(zhì)中的含錳超氧化物歧化酶(Manganese－containing superoxide dismutase，MnSOD，又稱為SOD2)和存在于細(xì)胞漿中或被分泌到細(xì)胞外液中的銅鋅超氧化物歧化酶(Copper－zinc containing superoxide dismutase，CuZnSOD 或SOD1)［2］。由于線粒體是產(chǎn)生 O－2的主要場(chǎng)所，因此MnSOD可能在保護(hù)細(xì)胞免受O－2氧化損傷中發(fā)揮重要作用。MnSOD作為細(xì)胞內(nèi)防止氧化應(yīng)激保護(hù)酶的重要作用已經(jīng)在基因敲除或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中得到證實(shí)，MnSOD基因敲除小鼠10天內(nèi)即因?yàn)樾募乃溃?］和神經(jīng)萎縮［4］而死亡。相反，轉(zhuǎn)基因小鼠線粒體中高度表達(dá)人MnSOD即可保護(hù)動(dòng)物免受氧化應(yīng)激產(chǎn)生的肺損傷［5］、急性阿霉素誘發(fā)的心肌損傷［6］和局部缺血引起的腦損傷［7］。近年來，對(duì)MnSOD的分子生物學(xué)研究和不同動(dòng)物MnSOD基因和cDNAs的分離，無疑促進(jìn)了MnSOD生理功能的研究。

1 MnSOD基因結(jié)構(gòu)

人們陸續(xù)克隆、測(cè)序和分析了人［8，9］、大鼠［10］、小鼠［11，12］和牛［13］MnSOD 全基因序列，這些動(dòng)物的MnSOD基因序列的結(jié)構(gòu)具有明顯的保守性，均含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。人、小鼠和牛MnSOD全基因均為單拷貝基因，但大鼠可能有2個(gè)拷貝。所有這4種動(dòng)物的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)相近，均具有看家基因的典型特征，即無上游 TATA 或 CAAT 盒子，但富含 GC［14，15］。

Meyrick等［13］比較了牛和大鼠MnSOD基因啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)種屬間明顯不同。在人MnSOD基因轉(zhuǎn)錄起始部位的上游，有一長(zhǎng)約400 bp的區(qū)段，G+C含量高達(dá)78%，集中分布著7個(gè)特異蛋白1(Specificity Protein－1， Sp1，5′－GGGCGG－3′) 和3個(gè)激活蛋白－2(Activator Protein－2，AP－2，5′－CCGCGGGCG－3′)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列［16］。牛轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前190 bp序列與人相似性較高，有8個(gè)Sp1和2個(gè)AP－2結(jié)合位點(diǎn)。與人和牛MnSOD基因啟動(dòng)子區(qū)分別含有7和8個(gè)Sp1結(jié)合序列不同，大鼠MnSOD基因啟動(dòng)子區(qū)只有2個(gè)Sp1結(jié)合序列［10］，且含有2個(gè)人和牛MnSOD基因啟動(dòng)子區(qū)沒有的SV40核心序列。很顯然，人MnSOD基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與牛的同源性比與大鼠的高，這與大哺乳動(dòng)物如牛、羊、豬和人與小動(dòng)物如小鼠和大鼠MnSOD基因轉(zhuǎn)錄有較大差異的報(bào)道相一致。

郝守峰等［17］對(duì)肉雞心肌細(xì)胞中與MnSOD基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合序列分析發(fā)現(xiàn)，在肉雞心肌細(xì)胞的核蛋白中存有與MnSOD基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子Sp1和AP－2，且能與MnSOD基因啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，其中在－79～－58有1個(gè)與人和大鼠相同的Sp1結(jié)合位點(diǎn)核心序列(5′－GGGGCGGG－3′)，在雞MnSOD基因啟動(dòng)子區(qū)中AP－2結(jié)合位點(diǎn)核心序列與現(xiàn)有文獻(xiàn)中報(bào)道的人和大鼠以及一些病毒AP－2結(jié)合位點(diǎn)核心序列不同，分別為位于－34～－14(5′－GGCGCAGGC－3′)和－338～ －319(5′－CCCAAGGTC－3′)。

對(duì)人和鼠MnSOD基因啟動(dòng)子區(qū)的分析發(fā)現(xiàn)，除多個(gè)Sp1和AP－2結(jié)合位點(diǎn)外，還含有核因子－卡巴B(Nuclear Factor－κB，NF－κB)和激活蛋白－1(Activator Protein－1，AP－1)等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，可能在 Mn－SOD 基因表達(dá)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用［10，16，18］。Zhang［19］從人白細(xì)胞基因組文庫中得到 1個(gè) MnSOD基因組DNA序列，其5′－端上游序列中又發(fā)現(xiàn)了一些重要的調(diào)節(jié)元件，如1個(gè)急性期反應(yīng)序列(Acute response element，ARE)、2 個(gè)與早期生長(zhǎng)因子 1 基因(Early growth response 1，Egr－1)調(diào)節(jié)序列(5′－GCGGGGGCG－3′)相近的序列(5′－GCGGGGCG－3′)等。MnSOD 基因結(jié)構(gòu)中存在與 Egr－1 基因類同的調(diào)節(jié)序列，是其具有輻射誘導(dǎo)特性的有力證據(jù)。

2 MnSOD基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控

盡管MnSOD在許多組織和細(xì)胞中的高水平表達(dá)，其表達(dá)仍受到多種細(xì)胞內(nèi)和環(huán)境因素的誘導(dǎo)，表明MnSOD是一個(gè)應(yīng)激反應(yīng)型基因［20］。上調(diào)MnSOD轉(zhuǎn)錄的因素有細(xì)胞因子如白細(xì)胞因子1(Interleukin－1，IL－1)［21～23］，腫瘤壞死因子－α(TNF－α)［22，24］、細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)［21］和干擾素－γ(Interferon－γ，IFN－γ)［25］。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的增強(qiáng)子元件位于小鼠［26］、大鼠和人［27］MnSOD 基因第 2 個(gè)內(nèi)含子的236 bp區(qū)，結(jié)合位點(diǎn)包括NF－κB，CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancer binding proteins，C/EBP)和核因子－1(Nulear factor－1，NF－1)。蛋白激酶 C(Protein kinase C，PKC)刺激因子十四烷酰法波(醇)醋酸酯(12－O－tetradecanoylphorbol－13－acetate，TPA)通過 CREB－1/ATF－1 類轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo) MnSOD 基因轉(zhuǎn)錄，但與NF－κB或AP－1無關(guān)［18］。一些抗腫瘤藥物如長(zhǎng)春滅瘟堿(vinblastin)、紫杉酚(taxol)和長(zhǎng)春新堿(vincristine)也是通過PKC誘導(dǎo)MnSOD基因轉(zhuǎn)錄［28］。血小板衍生的生長(zhǎng)因子通過轉(zhuǎn)錄因子Egr－1 誘導(dǎo) NIH3T3 細(xì)胞 MnSOD 基因轉(zhuǎn)錄［29］。

基因啟動(dòng)子區(qū)DNA順式結(jié)合元件與其相應(yīng)DNA結(jié)合蛋白即轉(zhuǎn)錄因子的互作是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵。MnSOD基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始部位上游集中分布的核轉(zhuǎn)錄因子Sp1和AP－2強(qiáng)烈提示，Sp1和AP－2轉(zhuǎn)錄因子在MnSOD基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中有重要作用。Sp1是一組具有3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)、與富含GC序列DNA結(jié)合的蛋白家族［30，31］。Sp1在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，以不同的親和力與特異序列結(jié)合，參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［32～35］。由于重疊排列的Sp1結(jié)合位點(diǎn)可以替代TATA或CAAT盒子在起始轉(zhuǎn)錄中的作用而直接啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄［36］，因此，在啟動(dòng)子區(qū)無TATA或CAAT盒子的基因即所謂的看家基因如二氫葉酸還原酶［37］、胸苷酸合成酶［38］和腺嘌呤脫氨酶［39］等，以及一些非看家基因如胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白－2［40］、雄激素受體［41］表皮生長(zhǎng)因子受體［42］和紅細(xì)胞內(nèi)特異酶基因如丙酮酸激酶［43］轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。

由于MnSOD啟動(dòng)子區(qū)無TATA或CAAT盒子，因此Sp1在MnSOD轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用更加重要。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Sp1是人MnSOD基因基礎(chǔ)性轉(zhuǎn)錄必需的正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子［20，44］，其調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制可能包括以下幾個(gè)方面:(1)招募基本轉(zhuǎn)錄裝置蛋白。Sp1可直接與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中的一些蛋白相互作用，從而通過招募基本轉(zhuǎn)錄裝置或促進(jìn)其裝配而激活基因轉(zhuǎn)錄。Sp1可通過谷氨酸富集區(qū)或C末端結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中的TFIID復(fù)合物相互作用［45］。TFIID復(fù)合物由多亞基組成，Sp1可與其中的TBP(TATA－box binding protein)和至少1種果蠅［dTAF(Ⅱ)110］和2種人TAFs(TBP associated factors)相互作用［hTAF(Ⅱ)130和hTAF(Ⅱ)55］。TAFs非基本轉(zhuǎn)錄所必需，但卻是介導(dǎo)多種轉(zhuǎn)錄因子及增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄激活作用的必需因子。除TAFs外，Sp1的轉(zhuǎn)錄激活作用還需要CRSp/Med復(fù)合物(cofactor required for Sp1/mediator)。CRSp可介導(dǎo)多種增強(qiáng)子結(jié)合因子和核心轉(zhuǎn)錄裝置之間的相互作用，該復(fù)合物亞基間的重組可能是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活作用基因特異性的機(jī)制［46］。(2)改變?nèi)旧|(zhì)修飾和染色體結(jié)構(gòu)。在啟動(dòng)子處，Sp1可同時(shí)招募組蛋白乙酰化酶和去乙?；竵韺?shí)現(xiàn)對(duì)該處組蛋白的乙?；癄顟B(tài)的快速動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，從而激活或抑制基因的表達(dá)［47，48］。Sp1可能與染色質(zhì)重塑復(fù)合體SWI/SNF家族的成員相互作用，從而通過改變?nèi)旧|(zhì)的可接近性來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄［49］。Sp1還被發(fā)現(xiàn)具有邊界活性，能結(jié)合于人β球蛋白基因座［50］，從而阻滯異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)布，維持基因的轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)。(3)引發(fā)DNA loop的形成。對(duì)于含有多拷貝Sp1結(jié)合位點(diǎn)的調(diào)節(jié)序列，Sp1可通過D結(jié)構(gòu)域形成多聚體而拉近相離甚遠(yuǎn)的DNA序列，使DNA形成環(huán)形，協(xié)同激活靶基因的表達(dá)［51］。Sp1首先形成4聚體，其后多個(gè)4聚體聚集于DNA結(jié)合位點(diǎn)。這種高度組織的多聚體起到了濃集蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的作用，從而提高了局部轉(zhuǎn)錄因子的濃度。

轉(zhuǎn)錄因子Sp1調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的基本前提是其DNA結(jié)合活性。Sp1 DNA結(jié)合活性的降低即意味著轉(zhuǎn)錄起始能力的喪失。Sp1 DNA結(jié)合活性提高可能有以下幾個(gè)原因:首先，Sp1基因表達(dá)量提高。小鼠胚胎發(fā)育過程中胸腺、肺、肝和脾臟等器官Sp1 mRNA表達(dá)量增加［52］。TPA激活人肝癌細(xì)胞HepG2中MnSOD基因轉(zhuǎn)錄提高時(shí)Sp1蛋白表達(dá)量也提高［53］。其次，與其他轉(zhuǎn)錄因子的互作。所有受Sp1調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子中均含有AP－2結(jié)合位點(diǎn)，AP－2通過與Sp1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)抑制轉(zhuǎn)錄［54］。另外，轉(zhuǎn)錄后修飾、糖基化、磷酸化或形成多聚體都會(huì)改變Sp1的DNA結(jié)合活性［55］。細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)也影響Sp1的DNA結(jié)合活性。由于半胱氨酸殘基廣泛存在于許多轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)，其氧化還原狀態(tài)直接影響轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，因此轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性對(duì)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)敏感。體外研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟中Sp1的DNA結(jié)合區(qū)隨年齡增長(zhǎng)逐漸被氧化，從而發(fā)生不可逆性的DNA結(jié)合活性降低［56］。衰老和氧化劑可引起Sp1蛋白DNA結(jié)合區(qū)半胱氨酸殘基氧化，從而降低Sp1的DNA結(jié)合活性;相反，還原劑如谷胱甘肽和硫氧還蛋白則可恢復(fù)Sp1的DNA結(jié)合活性［57，58］。Li等［59］發(fā)現(xiàn)，飼糧錳能提高肉雞心肌細(xì)胞中Sp1的DNA結(jié)合活性，推測(cè)錳可能通過MnSOD影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)Sp1的DNA結(jié)合活性。

細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)也影響AP－2的DNA結(jié)合活性。AP－2蛋白多肽鏈中有7個(gè)半胱氨酸殘基，其中6個(gè)半胱氨酸殘基位于DNA結(jié)合區(qū)和二聚體化功能區(qū)，2個(gè)半胱氨酸殘基位Cys222和Cys243正好位于DNA結(jié)合區(qū)［60］。AP－2是另一類與DNA特異序列結(jié)合的蛋白，其結(jié)合序列也富含GC，并以結(jié)合位點(diǎn)依賴方式刺激基因的選擇性表達(dá)［61，62］，在細(xì)胞發(fā)育、胚胎分化和腫瘤形成中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［63，64］。AP－2家族包括 AP－2α，AP－2β和AP－2γ［65］。雖然3種蛋白 N－末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)結(jié)構(gòu)不同，但DNA 結(jié)合 區(qū)卻高度保守。盡管AP－2在腫瘤基因erbB－2［66］，erbB－3［67］和細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)基因p21WAF1［68］轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起激活劑作用，但也發(fā)現(xiàn)它對(duì)幾個(gè)基因如星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原［69］、K3角蛋白［70］、乙酰膽堿酯酶［54］和C/EBP［71］的轉(zhuǎn)錄起抑制作用。SV40轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞中高濃度的AP－2蛋白明顯抑制MnSOD基因的表達(dá)，同樣WI38成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染SV40后MnSODmRNA和蛋白水平明顯降低［72，73］，表明AP－2在MnSOD基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起負(fù)調(diào)節(jié)作用。關(guān)于AP－2調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制，在前幾個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄抑制中，AP－2均是通過取代與AP－2結(jié)合位點(diǎn)臨近或重疊的正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子或與其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮其抑制作用，且AP－2蛋白與啟動(dòng)子區(qū)DNA的特異性結(jié)合是其發(fā)揮抑制作用的必要條件［74］。在MnSOD基因中，由于AP－2與DNA的結(jié)合能力比Sp1強(qiáng)，因此，AP－2可能與正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Sp1互作或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，從而有效抑制MnSOD基因的轉(zhuǎn)錄［36，74］。也有報(bào)道，Sp1與AP－2的比值決定基因的轉(zhuǎn)錄［70，75］。硒處理降低原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中AP－2的DNA結(jié)合活性，對(duì)SP1的DNA結(jié)合活性無影響，因此啟動(dòng)子區(qū)Sp1與AP－2的比值升高，MnSOD轉(zhuǎn)錄上調(diào)。另外，AP－2在穩(wěn)定染色體高級(jí)結(jié)構(gòu)中也可能發(fā)揮作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，MnSOD轉(zhuǎn)錄激活時(shí)染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化［76］。

NF－κB和AP－1是已知的直接受細(xì)胞內(nèi)ROS激活的轉(zhuǎn)錄因子［77］，同時(shí)這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子也是多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游作用因子［78］，是MnSOD基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的正調(diào)節(jié)因子。NF－κB在核質(zhì)中與抑制因子IkB結(jié)合而無激活活性，一旦IκB被磷酸化激活后(可能是受PKC激活)即降解，NF－κB與IκB分開而進(jìn)入核內(nèi)，并與其結(jié)合序列結(jié)合后激活基因轉(zhuǎn)錄。許多因素如細(xì)胞因子TNF－α和IL－1α［79］，細(xì)菌脂多糖LPS［21］，離子輻射和產(chǎn)生高氧的試劑如H2O2和二酰胺［80］均可引起IκB蛋白降解和NF－κB的激活?？寡趸瘎┮种茙缀跛写碳ひ蛩匾鸬腘F－κB激活，但是抗氧化劑如巰基還原劑對(duì)激活的NF－κB與DNA的結(jié)合活性卻有相反的作用，還原性巰基如DTT，半胱氨酸和還原型硫氧還蛋白能夠使NF－κB DNA結(jié)合區(qū)半胱氨酸殘基保持還原狀態(tài)，從而提高激活的NF－κB DNA結(jié)合活性。

氧化應(yīng)激、離子輻射和生長(zhǎng)因子通過誘導(dǎo)AP－1組分c－fos和c－jun的表達(dá)激活核轉(zhuǎn)錄因子AP－1，從而誘導(dǎo)人和果蠅MnSOD的表達(dá)［81］。AP－1蛋白中DNA結(jié)合區(qū)保守性半胱氨酸保持還原狀態(tài)仍是其DNA結(jié)合活性所必需的［82］。

多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與MnSOD基因表達(dá)的調(diào)節(jié)［27］。對(duì)ROS敏感的絲裂原激活蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)對(duì)細(xì)胞內(nèi)外刺激如紫外線［83］、ROS［84］及病毒［85］等產(chǎn)生應(yīng)答，并通過直接磷酸化特定的核轉(zhuǎn)錄因子從而影響其DNA結(jié)合活性，或與其它蛋白相互作用間接影響轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。MAPKs是一組刺激誘導(dǎo)型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal－regulated kinases，ERK)、c－Jun 氨基末端激酶(c－Jun amino－terminal kinases，JNK)和p38MAPK［86，87］。盡管每組MAPK通路都有許多各自獨(dú)特的特性，但每組通路都由依次順序激活的3個(gè)激酶即MAPK，MAPK激酶(MAPK kinase，MAPKK)和MAPK激酶(MAPKK kinase，MAPKKK)所組成［88，89］。ERKs主要對(duì)各種生長(zhǎng)刺激發(fā)生反應(yīng)，與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)［90］，而 JNKs和p38MAP激酶主要參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，如代謝、炎癥、氧應(yīng)激等［91，92］。肝炎病毒復(fù)制期引起的氧化應(yīng)激通過p38MAPK和JNK通路激活A(yù)P－1，增加MnSOD基因表達(dá)［93］。生理劑量的花生四烯酸通過H2O2激活p38MAPK途徑，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中MnSOD轉(zhuǎn)錄［84］。

綜上所述，由于MnSOD廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖和腫瘤的形成，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、離子輻射和神經(jīng)毒作用方面發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步研究MnSOD基因表達(dá)的特點(diǎn)，無論對(duì)預(yù)防細(xì)胞和組織生理性或病理性氧化損傷都具有重要意義。

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