方中明，黃瑋婷，吳坤林，江 南，曾宋君*

(1．中國科學(xué)院華南植物園華南農(nóng)業(yè)植物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510650;2．中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049;3．東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心，廣東東莞523000)

珍珠矮(Cymbidium．nanulum Y．S．Wu ＆ S．C．Chen)為蘭科蘭屬植物，屬于中國區(qū)域性特有的地生蘭，花期6月，花淡黃綠色或紫色，有香味，觀賞價(jià)值高［1-2］，野生資源已十分稀少．珍珠矮在自然條件下種子萌發(fā)率低，成苗難;人工栽培時(shí)主要靠分株繁殖，繁殖速度慢．珍珠矮的無菌播種和組織培養(yǎng)已有初步報(bào)道，但在根狀莖分化成芽的過程中，外植體易發(fā)生褐變，分化率較低［3-4］．植物組織培養(yǎng)中，常用的褐變抑制劑有活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、維生素C、二硫蘇糖醇、檸檬酸等［5-6］．作者已經(jīng)報(bào)道，培養(yǎng)基中添加檸檬酸能明顯減輕褐化，并提高根狀莖的出芽數(shù)［4］．本文研究在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的檸檬酸，觀察其對(duì)根狀莖分化和褐變的影響，測(cè)定與褐化相關(guān)的酶的活性和總酚含量，分析這些指標(biāo)和褐化及根狀莖分化出芽的關(guān)系，為進(jìn)一步開展珍珠矮及其它地生蘭的組織培養(yǎng)提供參考依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 材料

人工授粉后150 d的果實(shí)用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精表面消毒30 s后，再以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．1%的升汞溶液消毒15 min，無菌水沖洗4～5次．隨后將消毒的莢果置于滅菌的濾紙上吸干水分，用解剖刀切開莢果，將種子散落到種子萌發(fā)培養(yǎng)基1/2MS+10%的椰子汁+0．5 mg/L NAA+1 g/L活性炭的培養(yǎng)基上，4個(gè)月左右能形成根狀莖．根狀莖在1/2MS+6-BA 0．5 mg/L+NAA 2．0 mg/L+10% 的椰子汁+1 g/L活性炭培養(yǎng)上根狀莖能快速增殖．增殖所得到的根狀莖用于根狀莖分化和酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)．

1．2 根狀莖的分化

選取生長狀態(tài)相近的根狀莖，切割成長度為1．0 cm左右的切段，接種到添加不同質(zhì)量濃度檸檬酸 (0、0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0 g/L)的分化培養(yǎng)基(MS+NAA 0．5 mg/L+ 蔗糖 30．0 g/L+TDZ 0．1mg/L+6．0 g/L瓊脂)上進(jìn)行出芽誘導(dǎo)．每個(gè)處理10瓶，每瓶接種6個(gè)切段，重復(fù)3次．培養(yǎng)基的pH為5．4，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度30～40 μmol/(m2·s)，光照12 h/d．根狀莖在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)50 d能分化出芽，分化效率采用出芽數(shù)表示(出芽數(shù)=總出芽個(gè)數(shù)/接種的根狀莖數(shù))．試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11．0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，以Duncan’s新復(fù)極差在0．05水平上進(jìn)行顯著性差異分析．

1．3 酶活性的測(cè)定方法

1．3．1 多酚氧化酶(PPO)活性測(cè)定 按朱廣廉［7］的方法進(jìn)行，以每秒鐘A525的變化0．01為一個(gè)酶活性單位．

1．3．2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測(cè)定 參照李合生［8］的方法，以A290變化0．01為一個(gè)酶活性單位．

1．3．3 過氧化物酶(POD)活性測(cè)定 用愈創(chuàng)木酚法［8］，以每分鐘 OD470變化0．01為一個(gè)活性單位．

1．3．4 超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定 用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法［8］測(cè)定，以抑制NBT光化還原50%的酶液量為一個(gè)酶活性單位．

1．3．5 過氧化氫酶(CAT)活性 用紫外分光光度法［9］，以每分鐘吸光度值的降低表示活性．

1．3．6 總酚含量測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu(福林酚)法［10］．

2 結(jié)果與分析

2．1 檸檬酸對(duì)珍珠矮根狀莖分化和褐變的影響

和未加入檸檬酸(對(duì)照)相比(表1)，在分化培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的檸檬酸，根狀莖的平均出芽數(shù)顯著增加，隨著檸檬酸質(zhì)量濃度的升高，平均出芽數(shù)逐步升高，褐變程度變輕，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加1．0 g/L 檸檬酸時(shí)，平均出芽數(shù)最高，達(dá)到4．48，且生長良好，未見明顯褐化．當(dāng)檸檬酸高于1．0 g/L時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，褐色程度變重，根狀莖平均出芽數(shù)下降，且生長狀況變差．

表1 檸檬酸對(duì)珍珠矮根狀莖的分化和褐變的影響Table 1 Effects of CA concentration in medium on differentiation and browning inhibition of rhizomes of Cymbidium nanulum

2．2 培養(yǎng)基中檸檬酸質(zhì)量濃度對(duì)珍珠矮根狀莖中PPO、PAL、POD酶活性的影響

根狀莖在添加不同質(zhì)量濃度檸檬酸的分化培養(yǎng)基(MS+NAA 0．5 mg/L+ 蔗糖 30．0 g/L+TDZ 0．1 mg/L)上進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，POD、PPO、PAL三者活性變化趨勢(shì)一致(圖1)．添加的檸檬酸在 0．1～1．0 g/L時(shí)，隨著添加的檸檬酸質(zhì)量濃度的升高，珍珠矮根狀莖中PPO、PAL、POD酶活性開始下降，而當(dāng)添加的檸檬酸高于1．0 g/L時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，這3種酶的活性升高．根狀莖中3種酶的活性均以1．0 g/L檸檬酸處理的最低，除PPO酶活性與添加2．0 g/L檸檬酸，與其它質(zhì)量濃度相比，均表現(xiàn)出顯著性差異．

圖1 培養(yǎng)基中檸檬酸質(zhì)量濃度對(duì)PPO、PAL、POD酶活性的影響Figure 1 Effects of CA concentration in medium on the activities of PPO，PAL and POD

2．3 培養(yǎng)基中檸檬酸對(duì)珍珠矮根狀莖中SOD、CAT酶活性的影響

圖2 培養(yǎng)基中檸檬酸質(zhì)量濃度對(duì)SOD酶活性的影響Figure 2 Effects of CA concentration in medium on the activities of SOD

圖3 培養(yǎng)基中檸檬酸質(zhì)量濃度對(duì)CAT酶活性的影響Figure 3 Effects of CA concentration in medium on the activities of CAT

根狀莖在添加不同質(zhì)量濃度檸檬酸的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，SOD酶活性和CAT酶活性變化趨勢(shì)基本一致(圖2、圖3):檸檬酸在0．1～1．0 g/L范圍時(shí)，隨著檸檬酸質(zhì)量濃度的升高，這2種酶的活性均上升，而當(dāng)檸檬酸高于1．0 g/后時(shí)，這2種酶的活性逐漸下降．在所有處理中，SOD酶活性在檸檬酸含量為0．5、1．0、2．0 g/L 時(shí)，未表現(xiàn)出顯著性差異，在添加0．1或5．0 g/L檸檬酸，與未添加檸檬酸的對(duì)照相比也未表現(xiàn)出顯著性差異．而在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的檸檬酸時(shí)，CAT酶活性均高于對(duì)照，添加1．0 g/L檸檬酸時(shí)高于所有其它處理并表現(xiàn)出顯著性差異．

2．4 培養(yǎng)基中檸檬酸含量對(duì)珍珠矮根狀莖中總酚的影響

根狀莖在添加不同質(zhì)量濃度檸檬酸的分化培養(yǎng)基 MS+NAA 0．5 mg/L+ 蔗糖 30．0 g/L+TDZ 0．1 mg/L中培養(yǎng)時(shí)，檸檬酸在0．1～1．0 g/L時(shí)，根狀莖總酚含量減低，檸檬酸為1．0 g/L時(shí)，總酚含量最低，顯著低于其它所有的處理．超過此質(zhì)量濃度，隨著檸檬酸含量升高，總酚含量逐步升高，當(dāng)檸檬酸為5．0 g/L時(shí)，總酚含量顯著高于對(duì)照(圖4)．

圖4 培養(yǎng)基中檸檬酸質(zhì)量濃度對(duì)總酚含量的影響Figure 4 Effects of concentration of CA in medium on the total phenol content

3 討論

褐變是影響植物組織培養(yǎng)成功的重要因素．引起培養(yǎng)材料褐化的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等［11］．酚類物質(zhì)是外植體中酶促褐變反應(yīng)中的底物，總酚含量與褐化關(guān)系密切，是組織培養(yǎng)褐變的重要因素之一［12］;而PPO、POD和PAL氧化酚類物質(zhì)產(chǎn)生的代謝物擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，就會(huì)抑制其它酶的活性，毒害外植體組織．因此PPO、POD、PAL活性以及總酚含量的變化與褐化程度密切相關(guān)［13］，可作為褐變程度的參考．國蘭等在離體培養(yǎng)時(shí)都有褐變現(xiàn)象出現(xiàn)．蝴蝶蘭外植體褐變過程與PAL基因表達(dá)相關(guān)［14］，PAL的合成及活性的增加，是褐變發(fā)生的前提［15］．

本試驗(yàn)中，在培養(yǎng)基中添加0．1～1．0 g/L褐化抑制劑檸檬酸時(shí)，根狀莖平均出芽數(shù)增加，PPO、POD及PAL活性降低，同時(shí)總酚含量降低，當(dāng)檸檬酸含量為1．0 g/L時(shí)，平均出芽數(shù)最高，酶活性及總酚含量達(dá)到最低，培養(yǎng)基褐化得到了有效的抑制，并且有利于根狀莖分化．而檸檬酸含量超過1．0 g/L時(shí)，PPO、POD、PAL活性反而升高，可能因?yàn)闄幟仕岷窟^高，使植物細(xì)胞滲透勢(shì)過大，對(duì)酶活性及褐化抑制效果都變差，本試驗(yàn)中根狀莖的出芽數(shù)也顯示出下降的趨勢(shì)．檸檬酸是呼吸鏈中的一個(gè)抑制劑，在果實(shí)的褐變中作為抗褐變劑被使用．另外，由于檸檬酸鰲合酚類合成及氧化酶活性位點(diǎn)的Cu2+［16］，抑制了PPO等酶的活性，也影響材料褐變的程度．這與蝴蝶蘭［17］等中不同濃度檸檬酸處理在一定程度上抑制了褐化及相關(guān)酶活性的報(bào)道一致．外植體組織發(fā)生褐變時(shí)，膜脂過氧化加劇，導(dǎo)致膜透性增加，有關(guān)褐變發(fā)生的關(guān)鍵原因與細(xì)胞膜完整性被破壞．蝴蝶蘭外植體在褐變過程中，SOD和CAT活力均下降［17］．本試驗(yàn)中，在添加不同質(zhì)量濃度的檸檬酸后，SOD、CAT酶活性增高，說明組織細(xì)胞的膜脂過氧化減弱，褐化得到了較好控制．檸檬酸在1．0 g/L時(shí)對(duì)珍珠矮根狀莖分化出芽及控制褐化效果最好．

［1］WU Y S，CHEN SC．Two new species of Cymbidium from China［J］．Acta Phytotax Sin，1991，29(6):549-552．

［2］陳心啟，吉占和，羅毅波．中國野生蘭科植物彩色圖鑒［M］．北京:科學(xué)出版社，1999:118．

［3］和壽星，薛潤光，李兆光，等．蘭屬新種珍珠矮的組織培養(yǎng)與植株再生［J］．植物生理學(xué)通訊，2007，43(3):517-518．

［4］FANG ZM，HUANGW T，ZENGSJ，etal．In vitro propagation of Cymbidium nanuum Y．S．Wu et S．C．Chen［J］．Propag Ornam Plants，2011，11(3):149-155．

［5］何瓊英，張東方，王潤華．抗壞血酸預(yù)處理阻止香蕉吸芽外植體褐變的研究初報(bào)［J］．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，16(3):79-82．

［6］王義強(qiáng)，蔣舜村，石明旺，等．不同抗氧化劑對(duì)銀杏愈傷組織褐變影響的研究［J］．經(jīng)濟(jì)林研究，2003，21(4):21-23．

［7］朱廣廉，鐘文海，張愛琴．植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］．北京:北京大學(xué)出版社，1990:229-231．

［8］李合生．植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)［M］．北京:高教出版社，2000．

［9］陳曉敏．測(cè)定切花中過氧化氫酶活性的3種常用方法的比較［J］．熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，22(5):13-16．

［10］BONILLA E P，AKOH C C，SELLAPPAN S，et al．Phenolic content and antioxidant capacity of Muscadine grapes［J］．JAgr Food Chem，2003，51(18):5497-5503．

［11］ISHIIM，UEMOTO S，F(xiàn)UJIEDA K．Studies on tissue culture in cattleya species II:Preventivemethods for the browning of explanted tissue［J］．J Jap Soc Hort Sci，1979，48:199-204．

［12］AMCN R，AMMB D M．Polyphenoloxidase activity of minimally processed‘Jonagored’apples(Malus Domestica)［J］．JFood Process Pres，2005，29:8-19．

［13］許傳俊，李玲，李紅，等．蝴蝶蘭褐變外植體的顯微結(jié)構(gòu)觀察及褐變成分的初步分析［J］．園藝學(xué)報(bào)，2005，32(6):1111-1113．

［14］許傳俊，李玲，李紅．蝴蝶蘭葉片外植體褐變過程中PAL基因的表達(dá)變化［J］．熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2007，15(1):50-54．

［15］CAMPOSVARGASR，NONOGAKIH，SUSLOW T，et al．Isolation and characterization of a wound inducible phenylalanine ammonia-lyase gene(LsPAL1)from Romanine lettuce leaves［J］．Physiol Plant，2004，121:429-438．

［16］MARSHALLM R，KIM J，WEIC I．Enzymatic browning in fruits［J/OL］．Vegetables and Seafoods，2000，http://www．doh．gov．tw/http://www．fao．org/ag/Ags/agsi/ENZYMEFINAL/I．

［17］許傳俊，李玲．幾種培養(yǎng)基及光照對(duì)蝴蝶蘭葉片外植體褐變的影響［J］．亞熱帶植物科學(xué)，2006，35(1):9-12．