朋湯義 鄭書國

1.安徽省中醫(yī)院藥劑科，安徽合肥 230031；2. 皖南醫(yī)學(xué)院藥理教研室，安徽蕪湖 241002

氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧（reactive oxygen species， ROS）產(chǎn)生增加或清除減少，從而導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原自穩(wěn)態(tài)失衡，ROS在體內(nèi)大量蓄積而引起機(jī)體氧化損傷的過程?，F(xiàn)代研究表明，ROS參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，其介導(dǎo)的低密度脂蛋白（LDL）氧化修飾是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。氧化應(yīng)激學(xué)說的提出為應(yīng)用抗氧化劑防治AS提供了理論依據(jù)。番茄紅素為天然類胡蘿卜素類化合物，主要存在于番茄、西瓜等中，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。流行病學(xué)研究表明，血清及脂肪組織番茄紅素水平與動(dòng)脈粥樣硬化病變程度及心血管疾病發(fā)病率呈明顯負(fù)相關(guān)，增加番茄紅素?cái)z入可明顯降低冠心病發(fā)病率[1]，提示番茄紅素具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化作用。本研究主要研究番茄紅素在體內(nèi)外對(duì)LDL氧化的影響，以探討其抗AS的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

新西蘭白兔，雄性，體重2.0～2.5 kg，購自江蘇省南京金陵種兔場；番茄紅素由陜西森弗生物技術(shù)有限公司提供；兔Ox-LDL測(cè)試盒由大連泛幫生物技術(shù)公司提供；其他試劑均為分析純。752紫外分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，Bio-Rad；超速離心機(jī)，Beckman公司；高脂飼料，含膽固醇1.2%，豬油4%，普通飼料94.8%。

1.2 方法

1.2.1 LDL氧化易感性測(cè)定 取健康人靜脈血，EDTA抗凝，分離血漿，超速離心法分離LDL，并于4℃在10 mmol/L PBS（pH=7.4）中透析24 h，Bradford法測(cè)定LDL中蛋白質(zhì)含量，并調(diào)整濃度至1 mg/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、模型組（LDL+Cu2+）、番茄紅素組（LDL+Cu2++番茄紅素），每組6個(gè)樣本。于96孔培養(yǎng)板中加入LDL和PBS（終反應(yīng)體積0.2 mL，LDL終濃度為100 μg/mL），混勻。番茄紅素組分別加入不同濃度番茄紅素溶液（終濃度分別為5、10和20 μmol/L），對(duì)照組和模型組加入等量PBS，混勻，37℃孵育1 h。除對(duì)照組加入PBS外，其余各組均加入CuSO4溶液（終濃度5 μmol/L），37℃孵育3 h，每10分鐘測(cè)定1次234 nm處吸光度（A234）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A234為縱坐標(biāo)，繪制LDL氧化曲線，參照文獻(xiàn)[3]方法計(jì)算LDL氧化延遲時(shí)間（Lag time）和達(dá)最大氧化速率時(shí)間（Tmax）。將上述反應(yīng)體系繼續(xù)孵育至12 h，加入EDTA-Na2終止反應(yīng)，TBA比色法測(cè)定反應(yīng)液中MDA含量。

1.2.2 家兔高脂血癥模型建立與給藥 新西蘭白兔32只，隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組和番茄紅素高（20 mg/kg）、低劑量組（10 mg/kg），每組8只。除正常組喂飼普通飼料外，其余各組均給予高脂飼料。番茄紅素組每天早晨先給予含藥飼料（5 g/kg體重），待吃完后再給予高脂飼料，以保證藥物的完全攝入。每只家兔每天進(jìn)食總量控制為120 g左右，分2次于早晨和晚上投喂，自由飲水，共4 周。4周末家兔血清總膽固醇和LDL水平均較模型組顯著升高（P＜0.01）。數(shù)據(jù)略。

1.2.3 家兔血清Ox-LDL水平及LDL氧化易感性測(cè)定 分離血清，按試劑盒說明測(cè)定Ox-LDL水平。取EDTA（1 mg/mL）抗凝全血， 4℃離心分離血漿。密度梯度超速離心法分離LDL，按1.2.1中方法透析24 h，調(diào)整蛋白濃度至1 mg/mL。于96孔培養(yǎng)板中分別加入LDL （1 mg/mL） 20μL、PBS 160 μL（10 mmol/L）及 CuSO4溶液 20 μL（50 μmol/L），使 LDL和 CuSO4終濃度分別為0.1 mg/mL和5 μmol/L，混勻，置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中37℃孵育，按1.2.1中方法測(cè)定A234，繪制氧化曲線并計(jì)算LDL氧化的Lag time和Tmax。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 番茄紅素對(duì)LDL氧化易感性的影響

Lag time和Tmax是衡量LDL氧化易感性的兩個(gè)重要指標(biāo)。由表1可見，番茄紅素能顯著增加銅離子誘導(dǎo)LDL氧化的Lag time和Tmax，這一結(jié)果與其抑制MDA生成作用一致，提示番茄紅素能有效抑制銅離子誘導(dǎo)的LDL氧化。

表1 番茄紅素對(duì)銅離子誘導(dǎo)的LDL氧化的影響 （± s，n=6）

表1 番茄紅素對(duì)銅離子誘導(dǎo)的LDL氧化的影響 （± s，n=6）

注：與對(duì)照組比較，bP＜0.01； 與模型組比較 ，cP＜0.05，dP＜0.01

組別 劑量（μmol/L）Lag time（min）Tmax（min）MDA（nmol/mg protein）對(duì)照組 - - - 4.36±1.15模型組 - 52.54±19.35 102.85±24.86 18.46±3.55b番茄紅素組 5 61.76±17.33 122.50±24.66 12.88±2.71c 10 72.77±18.22c 145.36±29.84c 10.33±3.06c 20 79.58±19.66d 152.70±29.69d 8.74±2.88d

2.2 番茄紅素對(duì)家兔血清Ox-LDL水平及LDL氧化易感性的影響

由表2可見，喂飼高脂飼料4周后，家兔血清LDL抗氧化能力明顯下降，表現(xiàn)為Lag time和Tmax均明顯縮短（P＜0.01），同時(shí)血清Ox-LDL水平明顯升高（P＜0.01）；補(bǔ)充番茄紅素能顯著提高LDL氧化的Lag time和Tmax（P＜0.05或P ＜0.01），降低血清Ox-LDL水平（P＜0.05或P＜0.01），提示番茄紅素能明顯提高高脂血癥家兔LDL抗氧化能力，抑制LDL氧化。

3 討論

ROS是生物體在需氧代謝或巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)中產(chǎn)生的活性基團(tuán)或分子，具有高度氧化活性，極易攻擊生物膜中脂質(zhì)及核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，引起機(jī)體氧化損傷?，F(xiàn)代研究表明，ROS參與多種疾病的病理進(jìn)程，其中ROS介導(dǎo)的LDL氧化修飾，是AS形成與發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。各種AS危險(xiǎn)因素如高脂血癥、高血壓、糖尿病等均可增加ROS產(chǎn)生，引起LDL氧化，促進(jìn)AS的形成與發(fā)展。臨床資料顯示，AS患者血清及LDL抗氧化能力均較正常人顯著降低，血漿Ox-LDL水平明顯升高且與AS病變程度密切相關(guān)[5]。抗氧化劑如維生素E、維生素C及β胡蘿卜素等的攝入量與AS性心血管病發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，補(bǔ)充多酚類、類胡蘿卜素類等天然抗氧化劑能明顯提高機(jī)體及LDL抗氧化能力，降低心血管疾病死亡率[6-7]。這些結(jié)果提示，補(bǔ)充抗氧化劑、增強(qiáng)機(jī)體及LDL抗氧化能力可能是防治AS及其相關(guān)性心腦血管疾病有效途徑之一。

表2 番茄紅素對(duì)家兔血清Ox-LDL水平及LDL氧化易感性的影響 （± s，n=8）

表2 番茄紅素對(duì)家兔血清Ox-LDL水平及LDL氧化易感性的影響 （± s，n=8）

注：與對(duì)照組比較，bP＜0.01； 與模型組比較 ，cP＜0.05， dP＜0.01

Group Dose（mg/kg）Ox-LDL（μg/L）Lag time（min）Tmax（min）對(duì)照組 － 62.50±13.83 72.43±14.65 148.65±25.86模型組 － 126.28±30.68b 45.24±10.20b 103.65±21.48b番茄紅素組 20 82.84±19.25d 63.76±16.55d 139.36±25.48d 10 96.20±21.32d 59.54±14.78c 125.40±26.45c

番茄紅素為天然類胡蘿卜素類化合物，能明顯抑制AS的形成與發(fā)展[8]，但對(duì)其抗AS確切機(jī)制至今仍未完全闡明。本研究采用反映LDL氧化易感性的兩個(gè)主要指標(biāo)Lag time和Tmax[9]，觀察了番茄紅素對(duì)LDL氧化的影響。結(jié)果顯示，番茄紅素在體外能明顯延長LDL氧化的Lag time和Tmax，提示番茄紅素能有效提高LDL抗氧化能力，這一結(jié)果與其抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成相一致，說明番茄紅素能有效抑制LDL氧化?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素分子中含有長鏈共軛多烯結(jié)構(gòu)，它能通過物理和化學(xué)方法清除體內(nèi)單線態(tài)氧、過氧化自由基等活性氧，從而保護(hù)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等免受氧化損傷。此外，某些類胡蘿卜素類化合物如玉米黃質(zhì)、β胡蘿卜素等還能摻入生物膜或脂蛋白之中，當(dāng)遇到活性氧攻擊時(shí)，這些化合物首先被氧化，從而保護(hù)生物膜或脂蛋白免受氧化損傷。番茄紅素具有類似的結(jié)構(gòu)，且脂溶性較高，因而推測(cè)番茄紅素也可能通過摻入LDL之中而發(fā)揮抗氧化作用，從而抑制LDL氧化。體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)，番茄紅素能明顯提高高脂血癥家兔LDL抗氧化能力，降低血清Ox-LDL水平，說明番茄紅素在體內(nèi)也能有效抑制LDL氧化。大量研究表明，內(nèi)源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等可通過清除ROS而保護(hù)LDL不被氧化，提高這些抗氧化酶活性可明顯增強(qiáng)LDL抗氧化能力，抑制AS發(fā)生發(fā)展[10]。既往研究顯示，番茄紅素也可誘導(dǎo)活化某些內(nèi)源性抗氧化酶SOD、GSH-Px等的活性[11]，因此推測(cè)番茄紅素提高內(nèi)源性抗氧化酶活性可能是其抑制LDL氧化的機(jī)制之一。

綜上所述，番茄紅素在體內(nèi)外均能有效抑制LDL氧化，降低高脂血癥家兔血清Ox-LDL水平，其機(jī)制可能與番茄紅素直接清除ROS和提高機(jī)體抗氧化酶活性有關(guān)，這可能是番茄紅素抗AS主要機(jī)制之一。

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