劉靜，張海琴，凡星，沙莉娜，曾建，周永紅，4＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)小麥研究所，四川 成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安625014；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)資源與環(huán)境學(xué)院，四川 成都611130；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因資源與遺傳改良教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都611130）

小麥族（Triticeae）是禾本科（Poaceae）植物中十分重要的類群，既包含有重要的糧食作物如小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare），也有許多優(yōu)良的牧草資源如羊草（Leymus chinensis）和老芒麥（Elymus sibiricus）等［1］?；邴滎愖魑锖湍敛葙Y源的開(kāi)發(fā)、生態(tài)保護(hù)與重建的需要，理清小麥族內(nèi)物種分類問(wèn)題及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尤為重要。

猬草屬（Hystrix）是小麥族的一個(gè)多年生小屬，Moench［2］根據(jù)穎強(qiáng)烈退化或缺失的特征以Hystrix patula為模式種建立。根據(jù)Baden等［3］的分類系統(tǒng)，猬草屬有6種3變種：Hystrix patula、猬草（H.duthiei）、長(zhǎng)芒猬草（H.duthiei ssp.longearistata）、H.duthiei ssp.japonica、東北猬草（H.komarovii）、高麗猬草（H.coreana）、H.sibirica和H.californica。L9ve［4］認(rèn)為猬草屬模式種 H.patula具有與披堿草屬（Elymus）相同的StH染色體組組成，將猬草屬作為披堿草屬的一個(gè)組處理。然而，Jensen和 Wang［5］根據(jù)染色體組分析結(jié)果認(rèn)為，高麗猬草和H.californica含有與賴草屬（Leymus）植物相同的NsXm染色體組組成，并將它們組合到賴草屬中。Zhang等［6］根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)和染色體組原位雜交資料，報(bào)道H.patula含有StH染色體組，而猬草和長(zhǎng)芒猬草含有NsXm染色體組。Ellneskog－Staam等［7］通過(guò)基因組原位雜交（GISH）和Southern雜交分析認(rèn)為，猬草、長(zhǎng)芒猬草和高麗猬草含有Ns1Ns2染色體組，而東北猬草具有與猬草屬模式種H.patula相似的StH染色體組。因此，猬草屬不是一個(gè)單系類群，自建屬以來(lái)，屬的界限和分類地位以及物種的染色體組組成，一直處于爭(zhēng)論之中。

賴草屬是小麥族中重要的多年生異源多倍體屬，該屬植物約有30個(gè)種，從北海的沿岸地區(qū)，越過(guò)中亞到東亞直至阿拉斯加和北美西部的廣闊地域均有分布。賴草屬物種倍性變化從四倍體（2n＝4x＝28）到十二倍體（2n＝12x＝84），由2個(gè)基本的染色體組Ns和Xm組成［1，8］。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、染色體組分析及分子資料分析，認(rèn)為Ns染色體組來(lái)源于新麥草屬（Psathyrostachys）［1，4，8－12］，而 Xm 染色體組的來(lái)源尚不確定［8］。迄今為止，來(lái)源于擬鵝觀草屬（Pseudoroegneria）的St染色體組［13］、冠麥草屬（Lophopyrum）的Ee染色體組［14］、Eb染色體組［4］、新麥草屬的Ns染色體組［15］、冰草屬（Agropyron）的P染色體組和旱麥草屬（Eremopyrum）的F染色體組［11－19］被推測(cè)是Xm染色體組的供體來(lái)源。

細(xì)胞核基因資料已廣泛應(yīng)用于小麥族植物的遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化研究［11，16－18］，而細(xì)胞質(zhì)基因組具有單拷貝及母系遺傳的特征，在植物系統(tǒng)與進(jìn)化研究中具有更好的利用價(jià)值。rbcL、ndhF、trnL－F等葉綠體基因或基因間隔區(qū)序列已成功應(yīng)用于研究小麥族賴草屬、披堿草屬等類群的系統(tǒng)關(guān)系、網(wǎng)狀進(jìn)化及母系起源問(wèn)題［19－23］。Sha等［19］利用單拷貝核基因DMC和葉綠體trnL－F分子序列對(duì)猬草屬和賴草屬系統(tǒng)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，猬草屬物種具有不同的母本起源，猬草、長(zhǎng)芒猬草及歐亞分布的賴草屬植物的母本來(lái)源為新麥草屬植物，高麗猬草和東北猬草與北美分布的賴草的母本來(lái)源可能是冰草屬的P染色體組。Liu等［20］根據(jù)ITS及葉綠體trnL－F序列分析發(fā)現(xiàn)：歐亞分布的賴草屬植物母本起源為新麥草屬，而北美分布的賴草屬植物母本來(lái)源仍然未知，但推測(cè)不為新麥草屬。

葉綠體atpB－rbcL序列是位于編碼ATP合成酶β亞基和核酮糖1，5二磷酸羧化酶大亞基基因之間的非編碼區(qū)域，Nishikawa等［24］利用該序列探討了大麥屬的系統(tǒng)與進(jìn)化。本研究利用葉綠體atpB－rbcL序列對(duì)猬草屬及其近緣屬植物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，主要目的在于：1）分析猬草屬和賴草屬植物的系統(tǒng)關(guān)系；2）探討猬草屬與賴草屬植物可能的母本起源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共46份，包括5個(gè)猬草屬物種、來(lái)自北美、中亞及青藏高原的22個(gè)賴草屬物種、2個(gè)披堿草屬物種，以及來(lái)自小麥族8個(gè)不同基本染色體組的17個(gè)二倍體材料，包括4個(gè)新麥草屬（Ns染色體組）、2個(gè)擬鵝觀草屬（St染色體組）、2個(gè)大麥屬（Hordeum，H染色體組）、3個(gè)冰草屬（P染色體組）、2個(gè)旱麥草屬（F染色體組）、反穎南麥（Australopyrumretrofractum，W 染色體組）、簇毛麥（Dasypyrumvillosum，V 染色體組）、長(zhǎng)穗冠麥草（Lophopyrumelongatum，Ee染色體組）、百薩冠麥草（L.bessarabicum，Eb染色體組）等物種。旱雀麥（Bromus tectorum）作為外類群。所有材料的物種名稱、采集編號(hào)、來(lái)源及GenBank號(hào)列于表1。染色體組符號(hào)依照Wang等［8］的命名標(biāo)準(zhǔn)。所有材料均種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所多年生種質(zhì)圃，憑證標(biāo)本藏于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所標(biāo)本室（SAUTI）。

表1 供試材料Table 1 The materials used in this study

續(xù)表1 Continued

1.2 DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序

DNA提 取 采 用 改 良 的 CTAB 法［25］。PCR 擴(kuò) 增 引 物 序 列 為 P1：5′－ACATCGTAAGTACGTGGACCAATAA－3′和P2：5′－TTGGATTCTAAAGCTGGTGTT－3′［24］。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在 ABI 9700型PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體積為50μL，包括3μL DNA模板（約0.5μg，由Gel Doc圖像分析儀測(cè)得），10×ExTaq緩沖液（5μL），2.5mmol／L MgCl2（4.0μL）、2.5mmol／L 4種dNTP混合液（pH 8.0）（4.0μL）、15μmol／L正、反向引物（各1.5μL），5U／μL ExTaq酶（0.6μL）和ddH2O（30.4μL）。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，50℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖進(jìn)行電泳，用OMEGA試劑盒（OMEGA Bio－Tek）進(jìn)行割膠回收。然后，以pMD18－T載體（Takara）為連接載體，DH10B作為宿主菌，對(duì)目的片段進(jìn)行克隆。每份材料選取3～5個(gè)陽(yáng)性克隆用于DNA序列測(cè)序。序列測(cè)定由上海華大生物技術(shù)有限公司完成。所有序列均進(jìn)行雙向測(cè)序。DNA提取到測(cè)序完成于2009年3－11月。

1.3 基因序列分析

根據(jù)新麥草（Psathyrostachys juncea）的atpB－rbcL序列（GenBank序列號(hào) AB078409）［24］對(duì)本研究獲得的序列進(jìn)行確認(rèn)。采用DNAMAN軟件包（version 5.2.10；Lynnon Biosoft，http：／／www.lynnon.com）對(duì)序列進(jìn)行多重排定后再輔以手工校正，并進(jìn)行序列長(zhǎng)度變異、插入／缺失（Indel）分析。序列的堿基組成及替代用MEGA 4.0（Kumar S，Tamura K，Jakobsen I，Nei M，http：／／www.megasoftware.net）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。序列變異位點(diǎn)采用PAUP4.0b10（Swofford D L，Sinauer Associates，http：／／www.sinauer.com）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)?；谵D(zhuǎn)換和顛換與遺傳距離的線性關(guān)系，采用DAMBE（V4.1.33）［26］替代飽和性分析，選用的進(jìn)化模型是F84。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析采用最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony，MP）和貝葉斯推斷（bayesian inference，BI）。MP分析由PAUP4.0b10Win（Swofford，2003）軟件進(jìn)行，采用啟發(fā)式（Heuristic）搜索，gap作為缺失（missing）處理，數(shù)據(jù)隨機(jī)添加（addseq＝random），重復(fù)次數(shù)（nreps）為100，樹(shù)等分與重連分之交換法（TBR）構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，計(jì)算50%多數(shù)一致樹(shù)和嚴(yán)格一致樹(shù)，并采用1 000次重復(fù)抽樣（replicates）的自展分析（bootstrap，BS）來(lái)檢驗(yàn)。貝葉斯推斷采用 MrBayes 3.1.2［27］軟件分析。利用 Modeltest 3.7［28］進(jìn)行模型和參數(shù)估計(jì)，基于hLRT 標(biāo)準(zhǔn)選擇的最適堿基替代模型是 K81UF。BI分析中，4條馬爾可夫鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Markov Chain Monte Carlo，MCMC）運(yùn)行1 500 000代，以隨機(jī)樹(shù)為起始樹(shù)，每100代取樣1次，開(kāi)始的250個(gè)樣本作為老化樣本（burn－in samples）舍棄，剩下的樹(shù)用于構(gòu)建50%多數(shù)一致性樹(shù)（BI樹(shù)），并以后驗(yàn)概率（posterior probability，PP）來(lái)評(píng)估其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

葉綠體atpB－rbcL基因間隔區(qū)序列長(zhǎng)度變異為773～813bp，平均GC含量30.5%。所有序列排序后共得到831個(gè)排列位點(diǎn)，其中保守位點(diǎn)764個(gè)，可變位點(diǎn)46個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)21個(gè)。序列飽和性分析顯示轉(zhuǎn)換和顛換與遺傳距離F84呈線性關(guān)系（圖1），表明不同序列和不同位點(diǎn)間突變沒(méi)有達(dá)到飽和，可用于系統(tǒng)發(fā)育分析。

圖1 atpB－rbcL序列的飽和性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Substitution saturation analysis of atpB－rbcL

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

采用MP和BI兩種方法構(gòu)建atpB－rbcL系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。MP分析獲得1 632棵最大簡(jiǎn)約樹(shù)，樹(shù)長(zhǎng)（tree length）為72，一致性指數(shù) CI（consistency index）為0.944 4，保持性指數(shù) RI（retention index）為0.966 7，50%多數(shù)一致性樹(shù)與通過(guò)BI分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致。圖2顯示的是BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

在構(gòu)建的BI樹(shù)中，所有供試物種分別聚為A、B兩個(gè)分支。分支A包括：2個(gè)猬草屬物種（猬草、長(zhǎng)芒猬草）、4個(gè)新麥草屬物種、所有歐亞分布的賴草屬物種以及來(lái)自北美的濱麥（L.mollis），統(tǒng)計(jì)支持率（97%PP，65%BS），羊草位于該分支底部。分支A中的物種其atpB－rbcL序列上均含有1個(gè)5bp的ATATA插入。分支B中，猬草屬模式種H.patula與含StH染色體組的加拿大披堿草（E.canadensis）聚為姊妹支（支持率為100%PP，85%BS），再與含St染色體組的穗狀擬鵝觀草（P.spicata）、擬鵝觀草（P.strigosa），以及簇毛麥（V）、長(zhǎng)穗冠麥草（Ee）和百薩冠麥草（Eb）聚為亞支Ⅰ；冰草屬（P染色體組）、旱麥草屬（F染色體組）物種和反穎南麥（W染色體組）聚為亞支Ⅱ；3個(gè)北美賴草無(wú)芒賴草（L.triticoides）、灰賴草（L.cinereus）、鹽生賴草（L.salinus）聚為亞支Ⅲ；剩下的2個(gè)猬草屬物種（高麗猬草、東北猬草）、2個(gè)北美分布的賴草屬物種新枝賴草（L.innovatus）、科羅拉多賴草（L.ambiguus）以及2個(gè)大麥屬物種布頓大麥（H.bogdanii）、智利大麥（H.chilense）與3個(gè)亞支形成平行分支（圖2）。

3 討論

3.1 猬草屬和賴草屬植物的系統(tǒng)關(guān)系

猬草屬因以其穎退化乃至缺失的形態(tài)特征區(qū)別于小麥族其他屬，Baden等［3］認(rèn)為猬草屬是一獨(dú)立有效的屬。然而，染色體組分析和分子系統(tǒng)學(xué)研究表明：模式種H.patula含StH染色體組，東北猬草具變異的StH染色體組，而猬草屬的猬草、長(zhǎng)芒猬草和高麗猬草含有與賴草屬一致的NsXm染色體組［5－7，29，30］。

本研究中，猬草屬物種聚成不同的分支。猬草屬模式種H.patula與披堿草屬（StH染色體組）及擬鵝觀草屬（St染色體組）物種聚為一支，表明H.patula與披堿草屬植物有較近的親緣關(guān)系，支持細(xì)胞學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果［18，23，29，30］，將H.patula組合到披堿草屬中。猬草、長(zhǎng)芒猬草、高麗猬草和東北猬草則與新麥草屬（Ns染色體組）和賴草屬（NsXm染色體組）聚在一起，表明該4種猬草屬物種與新麥草屬和賴草屬植物的系統(tǒng)關(guān)系較近，支持猬草、長(zhǎng)芒猬草、高麗猬草含NsXm染色體組，并將它們組合到賴草屬中的分類處理［5，6］。

關(guān)于東北猬草的染色體組組成，有不同的報(bào)道。Ellneskog－Staam等［7］認(rèn)為東北猬草的染色體組組成為StH；而分子系統(tǒng)學(xué)研究及染色體組特異RAPD分析表明，東北猬草與含Ns染色體組的新麥草屬和賴草屬親緣關(guān)系較近［30－32］。本研究中，東北猬草與高麗猬草及北美分布的賴草屬物種聚在一支，而沒(méi)有與含StH染色體組的披堿草屬及H.patula聚類，表明東北猬草與賴草屬物種關(guān)系較近，而與含StH染色體組的披堿草屬物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

猬草和長(zhǎng)芒猬草與柴達(dá)木賴草（L.pseudoracemosus）等中亞分布的賴草屬物種及含Ns染色體組的新麥草屬物種聚為一支，高麗猬草、東北猬草則與北美分布的賴草屬物種處于另一分支，表明猬草、長(zhǎng)芒猬草與中亞分布的賴草屬物種關(guān)系更為緊密，而高麗猬草和東北猬草與北美分布的賴草屬物種關(guān)系密切。單拷貝核基因DMC1和Acc1的分子數(shù)據(jù)也顯示賴草屬物種存在歐亞和北美類群的差異［11，19］。Fan等［11］對(duì)世界范圍內(nèi)的賴草屬植物分子系統(tǒng)與進(jìn)化研究推測(cè)：北美賴草屬植物很可能是從東亞經(jīng)由白令陸橋向北美擴(kuò)散的。從地理分布上看，高麗猬草、東北猬草處于歐亞大陸東端，與白令海峽接近。本研究結(jié)果也表明高麗猬草、東北猬草與北美賴草具有較近的親緣關(guān)系。

Wen［33］指出相似的生境可能產(chǎn)生相似的選擇壓，從而導(dǎo)致物種形成相近的形態(tài)變異。猬草屬植物常生長(zhǎng)于溫暖、潮濕的自然環(huán)境中，含不同染色體組組成的物種其形態(tài)上的相似可能是自然選擇中趨同進(jìn)化的結(jié)果。

3.2 猬草屬和賴草屬植物可能的母本起源

細(xì)胞遺傳學(xué)資料表明：H.patula含有與披堿草屬植物相同的StH染色體組，其中St染色體組起源于擬鵝觀草屬，H染色體組來(lái)源于大麥屬［1，4，29］。在本研究中，H.patula與含StH染色體組的披堿草屬及擬鵝觀草屬（St）物種聚為一支，表明H.patula及披堿草屬的母本供體為擬鵝觀草屬植物。本研究結(jié)果與前人對(duì)披堿草屬母本來(lái)源的研究結(jié)果一致［21，34，35］。同時(shí)，擬鵝觀草屬物種與含Ee、Eb及V染色體組的物種聚為一支，表明擬鵝觀草屬的St染色體組和長(zhǎng)穗冠麥草的Ee染色體組、百薩冠麥草的Eb染色體組及簇毛麥的V染色體組關(guān)系密切，這一結(jié)果與基于葉綠體trnL－F序列對(duì)相關(guān)類群進(jìn)行的聚類結(jié)果一致［20，36］。

圖2 atpB－rbcL序列的BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 BI tree inferred fromatpB－rbcL sequences

Sha等［19］和Liu等［20］基于葉綠體trnL－F序列的分析，認(rèn)為猬草屬及賴草屬物種的母本起源存在多元性。Sha等［19］認(rèn)為猬草、長(zhǎng)芒猬草及歐亞分布的賴草屬植物的母本來(lái)源為新麥草屬植物，高麗猬草和東北猬草與北美分布的賴草的母本來(lái)源可能是冰草屬的P染色體組。Liu等［20］研究認(rèn)為歐亞分布的賴草屬植物母本起源為新麥草屬，而北美分布的賴草屬植物母本來(lái)源仍然未知，但推測(cè)不為新麥草屬。本研究中，具NsXm染色體組的物種其葉綠體atpB－rbcL序列明顯聚為2個(gè)分支，其中：猬草、長(zhǎng)芒猬草及所有歐亞分布的賴草屬物種與4個(gè)新麥草屬植物聚為一個(gè)分支（Ns支），而高麗猬草、東北猬草和5個(gè)來(lái)自美洲的賴草屬物種處于另一分支。結(jié)果表明猬草、長(zhǎng)芒猬草及歐亞分布的賴草屬物種以新麥草屬（Ns）作為母本供體，而高麗猬草、東北猬草及北美分布的賴草屬植物的母本來(lái)源可能為Xm染色體組。由于Xm染色體組確切的二倍體供體物種未知，所以高麗猬草、東北猬草及北美分布的賴草屬植物的母本來(lái)源還有待進(jìn)一步研究。

本研究中，來(lái)自北美的濱麥在atpB－rbcL序列上缺少其他北美賴草所共有的7bp（TGAAAAA）的插入片段，而和歐亞賴草聚在一起。從地理分布看，濱麥不僅分布于北美，也廣泛分布于中國(guó)北方沿海地區(qū)、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、朝鮮和日本［37］；從形態(tài)上看，濱麥與歐亞的沙生賴草（L.arenarius）、大賴草（L.racemosus）形態(tài)相似，甚至曾作為沙生賴草的亞種ssp.mollis處理［38］。因此，盡管濱麥來(lái)自北美，但與歐亞賴草有更近的親緣關(guān)系，其母本供體仍為Ns染色體組。

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