郭慧娟，胡濤，傅金民

（中國(guó)科學(xué)院武漢植物園植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430074）

土地鹽堿化已成為世界性的環(huán)境問題。一般在氣候干燥的半干旱、干旱地區(qū)由于降水量少而蒸發(fā)強(qiáng)烈，鹽分不斷積累于地表；而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，長(zhǎng)期不合理的施用化肥及用污水灌溉都會(huì)造成土壤鹽漬化。由于環(huán)境變化和土地的不良使用，使得土地鹽堿化趨勢(shì)加?。?］。據(jù)報(bào)道，全世界約有4億公頃的鹽漬土，約占灌溉農(nóng)用地的1／3，在中國(guó)6.7×107hm2耕地中就有10%的鹽漬化土壤。鹽堿脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降的主要非生物逆境因素［2］。土壤中的致害鹽類除了以NaCl為主的中性鹽以外，還有以Na2CO3和NaHCO3為主的堿性鹽，目前我國(guó)內(nèi)陸鹽堿地蘇打鹽堿土占的比重也越來越大［3］，由于上述堿性鹽的存在，這類土壤的pH可以高達(dá)9以上。正常情況下，植物在生命活動(dòng)中產(chǎn)生的活性氧自由基存在著產(chǎn)生和消除的動(dòng)態(tài)平衡。環(huán)境脅迫引起的滲透脅迫和離子毒害使植物細(xì)胞的葉綠體和線粒體在電子傳遞中的電子數(shù)量增加，活性氧產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞［4，5］，超氧陰離子和H2O2等活性氧的積累誘發(fā)膜脂過氧化，使膜透性增加，從而導(dǎo)致膜系統(tǒng)的氧化和細(xì)胞傷害，給植物體造成嚴(yán)重的損傷［6］，使植株的光和作用下降，產(chǎn)量降低［7］?；钚匝跚宄到y(tǒng)由酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)組成。超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）與過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxydase，POD）以及B2胡蘿卜素等物質(zhì)協(xié)同作用，可防御活性氧或其他過氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害。堿脅迫條件下，它們作為氧自由基的清除者，可以減輕逆境對(duì)植物細(xì)胞的傷害［8］。

迄今為止有關(guān)植物抗鹽生理的研究仍然以NaC1為主要對(duì)象的鹽脅迫為主，而自然生境對(duì)植物的危害不單有鹽脅迫，同時(shí)也有堿脅迫，尤其是以Na2CO3和NaHCO3為主的蘇打堿對(duì)植物的危害較大。鹽堿脅迫是植物生長(zhǎng)最主要也是最常見的非生物脅迫之一，對(duì)于大多數(shù)生長(zhǎng)在鹽堿土生境中的植物來說，它們不僅要遭受Na＋毒害，還要忍受高水平pH對(duì)生長(zhǎng)的影響。本研究選擇多年生黑麥草（Lolium perenne）作為研究對(duì)象，它是一種重要的禾本科牧草和草坪草，喜溫濕、耐瘠薄、耐鹽堿，在新平整的生土或新開墾的鹽荒地上均可生長(zhǎng)，廣泛分布于溫帶地區(qū)。作為牧草，黑麥草的草質(zhì)優(yōu)良，產(chǎn)量高，葉量豐富，莖葉柔嫩，適口性好，是馬、牛、羊、兔草食家畜的優(yōu)質(zhì)牧草；也是養(yǎng)魚的好飼料。做為草坪草，黑麥草具有建坪速度快、覆蓋能力和抗病蟲害能力以及分蘗能力強(qiáng)等特性。因此多年生黑麥草是一種理想的研究材料［9］。對(duì)于多年生黑麥草的堿脅迫效應(yīng)，國(guó)內(nèi)外極少報(bào)道。本試驗(yàn)從多年生黑麥草的生長(zhǎng)狀況及其光合色素含量和抗氧化作用方面探討蘇打堿對(duì)其的脅迫效應(yīng)，以探討多年生黑麥草堿脅迫的適應(yīng)機(jī)制，并揭示其耐堿的可能機(jī)理，為進(jìn)一步利用鹽堿地（主要是堿土）種植黑麥草提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)于2010年7月7日－8月24日在中國(guó)科學(xué)院武漢植物園進(jìn)行，多年生黑麥草quickstarⅡ的種子由中國(guó)科學(xué)院武漢植物園草坪種質(zhì)資源學(xué)科實(shí)驗(yàn)室提供。黑麥草種子在裝有沙子的一次性水杯中萌發(fā)，每天用半劑量Hoagland營(yíng)養(yǎng)液少量多次的澆灌，并保證上半層沙子處于濕潤(rùn)的狀態(tài)，約50d后將幼苗轉(zhuǎn)移到300mL三角瓶中，用半劑量的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液完全水培，培養(yǎng)7d后可進(jìn)行堿脅迫實(shí)驗(yàn)。為防止藻類植物在水培液中生長(zhǎng)，三角瓶外面用錫箔紙包裹。

1.2 方法

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)不同pH梯度的蘇打堿處理液，即去離子水pH＝6.5（對(duì)照）、pH＝8.2、pH＝9.1、pH＝9.9、pH＝10.9。分別配置0.1mol／L的 Na2CO3和0.1mol／L的 NaHCO3溶液，并將上述溶液按照0∶0，0∶10，1∶9，5∶5，9∶1的比例配成相應(yīng)pH值處理液，每個(gè)處理4次重復(fù)，溫度控制在19～21℃，光照時(shí)間為14 h／10h（晝／夜）。處理4d后，分別測(cè)定和計(jì)算各處理的相對(duì)蒸騰速率、含水量、株高、根長(zhǎng)、根冠比、葉綠素含量等生長(zhǎng)狀況指標(biāo)以及抗氧化酶的活性。

1.2.1 相對(duì)蒸騰速率的測(cè)定 蒸騰速率是一個(gè)與植物的生長(zhǎng)密切相關(guān)，并且比較容易和快速得到的指標(biāo)。每隔24h將密封好的三角瓶稱重并記錄數(shù)據(jù)，將前一天的數(shù)據(jù)減去當(dāng)天的數(shù)據(jù)得出來的差值就是這24h之內(nèi)的絕對(duì)蒸騰速率。為了糾正正常生長(zhǎng)的幼苗長(zhǎng)得越快，蒸騰量越大的錯(cuò)誤觀點(diǎn)，通過計(jì)算可以得出相對(duì)蒸騰速率（normalized relative transpiration，NRT）。

式中，T代表多年生黑麥草幼苗的絕對(duì)蒸騰速率（g／h），t代表時(shí)間段（0～24h，24～48h，…），C代表溶液濃度（g／L），i代表實(shí)驗(yàn)的重復(fù)1，2，...，n，j代表對(duì)照組實(shí)驗(yàn)重復(fù)1，2，...，m。

1.2.2 含水量、株高、根長(zhǎng)和根冠比的測(cè)定 處理結(jié)束后，將多年生黑麥草幼苗沖洗干凈，并把多余的水吸干，分別用直尺測(cè)量一下植株的株高和根長(zhǎng)，并記錄數(shù)據(jù)，根冠比用植株的根長(zhǎng)比株高得出的商值。然后稱量植株的總鮮重，再將葉和根分開，并分別稱量鮮重。然后用牛皮紙袋將鮮樣包好，于烘箱中110℃殺青30min，后在70℃烘干至恒重并進(jìn)行干物質(zhì)重測(cè)定。含水量的計(jì)算公式為

式中，F(xiàn)W為葉和根的鮮重，DW為干物質(zhì)重。

1.2.3 葉綠素的提取 取處理后的完全展開功能葉片0.1g，放入含10mL二甲亞砜（DMSO）的離心管中，暗中放置2～3d（至葉子失綠），每天混勻1次。吸取1mL萃取液于離心管中，加入DMSO 2mL，混勻。以DMSO為空白對(duì)照，使用分光光度計(jì)測(cè)定OD663、OD645值。并按下式計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的含量。

1.2.4 粗酶液的提取 稱取0.3g完全展開功能葉片，將葉片置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀，加入4mL 4℃預(yù)冷的150mmol／L、pH 7.0的磷酸緩沖溶液（PBS），將勻漿轉(zhuǎn)入10mL離心管中，12 000r／min、4℃離心20min，上清液即為粗酶提取液。

1.2.5 可溶性蛋白含量的測(cè)定 參照 Bradford［10］的方法。取0.03mL粗酶液加0.07mL 150mmol／L、pH 7.0的磷酸緩沖溶液，加入Brandford染液（0.01%考馬斯亮藍(lán)、4.7%乙醇、8.5%磷酸，用錫箔紙包好避光）后充分振蕩，用分光光度計(jì)測(cè)量OD595，通過由牛血清蛋白溶液繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出可溶性蛋白含量。

1.2.6 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 參照Zhang和 Kirkham［11］的方法。稱取100g TCA（三氯乙酸）、2.5g TBA（硫代巴比妥酸），加雙蒸水定容至500mL作為反應(yīng)液。取1mL粗酶液加入到2mL反應(yīng)液中，混合液在95℃水浴30min后迅速冷卻至室溫，振蕩離心管以消除氣泡，在12 000r／min、20℃離心10min，取上清液，以反應(yīng)液為空白測(cè)定OD532、OD600。

式中，L為提取液體積（mL）；l為比色杯厚度（cm）；ε為摩爾吸光系數(shù)（155L／mmol·cm）；FW為樣品鮮重。

1.2.7 超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定 參照 Giannopolitis和 Ries［8］的方法。用雙蒸水配制1.125mmol／L氮藍(lán)四唑（NBT）、195mmol／L甲硫氨酸（Met）、0.06mmol／L核黃素、3μmol／L EDTA－Na2溶液。將0.1mL粗酶液與2.2mL pH 7.8的磷酸緩沖液、0.2mL Met溶液、0.2mL NBT 溶液、0.1mL EDTA－Na2溶液、0.2 mL核黃素溶液，以不加粗酶液和NBT溶液的混合液為空白對(duì)照，以不加粗酶液的混合液為處理對(duì)照，搖勻后將裝有混合液的透明玻璃燒杯置于4 000lx熒光燈下顯色反應(yīng)60min，要求各燒杯照光一致，另將一支對(duì)照管置于暗中，反應(yīng)溫度控制在25～35℃。反應(yīng)結(jié)束后用黑布遮蓋試管終止反應(yīng)，以暗中對(duì)照管作空白調(diào)0，測(cè)定波長(zhǎng)560nm下的吸光度。以抑制光下對(duì)照管NBT光還原反應(yīng)50%的酶量作為1個(gè)SOD活性單位。

式中，ACK為空白對(duì)照在560nm下的吸光度；Atreatment為處理樣品在560nm的吸光度；FW為樣品鮮重。

1.2.8 過氧化物酶（POD）活性的測(cè)定 參照Chance和 Maehly［12］的方法。用50%的乙醇配置0.25%的愈創(chuàng)木酚，用雙蒸水配置0.75%的 H2O2溶液、0.1mol／L pH 5.0的醋酸緩沖溶液。取0.05mL粗酶液與1mL愈創(chuàng)木酚溶液、1.85mL醋酸緩沖溶液、0.1mL H2O2混合于離心管中，充分搖勻；以不加酶液管調(diào)0，測(cè)定波長(zhǎng)460nm下的吸光度，于3min內(nèi)每隔1min讀數(shù)1次。以1min內(nèi)A460增加1為1個(gè)酶活性單位（U）。

式中，ΔA460為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)樣品在460nm下吸光度的變化；FW為樣品鮮重。

1.2.9 過氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定 參照 Wang和 Huang［13］的方法。取0.1mL粗酶液加1.9mL 50 mmol／L、pH 7.4的磷酸緩沖溶液，1mL 45mmol／L H2O2溶液，充分振蕩，測(cè)量波長(zhǎng)240nm下的吸光度，3min內(nèi)每鎘1min讀數(shù)1次。以1min內(nèi)A240降低0.01為1個(gè)酶活性單位（U）。

式中，ΔA240為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)樣品在240nm下吸光度的變化；FW為樣品鮮重。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），以及平均數(shù)LSD多重比較檢驗(yàn)，差異顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫對(duì)多年生黑麥草生長(zhǎng)狀況和植株含水量的影響

從外觀上看，多年生黑麥草的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重的抑制。首先，和對(duì)照相比，植株的地上部有不同程度的萎蔫失水，葉片皺縮，失綠發(fā)黃等，而且根部也出現(xiàn)了縮短、發(fā)黑和潰爛的現(xiàn)象，這一系列反應(yīng)就是人們俗稱的“燒苗”。遭受鹽堿脅迫的幼苗株高比對(duì)照的矮，差異顯著，但是隨著pH的升高，株高的下降并不明顯（表1）；與對(duì)照相比，根長(zhǎng)都顯著降低，處理pH＝8.2、pH＝9.1和pH＝9.9之間差異顯著，而當(dāng)pH＝10.9時(shí)，根長(zhǎng)和pH＝9.9處理的根長(zhǎng)相等；當(dāng)pH＝8.2和pH＝9.1時(shí)，植株的根冠比與對(duì)照相比出現(xiàn)了顯著的增大，而其他處理的根冠比與對(duì)照無顯著差異。

含水量是直接反映鹽脅迫對(duì)植物造成滲透脅迫大小的指標(biāo)。植物體內(nèi)必須維持一定的含水量才能進(jìn)行各種代謝反應(yīng)和保持正常生長(zhǎng)狀態(tài)，進(jìn)行光合作用，維持正常生長(zhǎng)發(fā)育。不同pH值的鹽堿脅迫下，黑麥草幼苗葉片的含水量均顯著下降（表1）。但當(dāng)pH達(dá)到9.9，葉片含水量為42.6%，隨著pH的增大，葉片含水量下降不顯著。對(duì)于植株的地下部——根而言，隨著pH的增加，含水量的下降幅度較小，pH＝8.2時(shí)，根的含水量下降的幅度并不顯著。而當(dāng)pH＞9.1時(shí)，根系含水量顯著下降，但是各處理之間的差異并不顯著。

表1 pH值對(duì)多年生黑麥草株高、根長(zhǎng)、根冠比以及植株含水量的影響Table 1 Effects of pH on the shoot height，root length，the ratio of root to shoot and the water content of ryegrass seedlings

2.2 鹽堿脅迫對(duì)多年生黑麥草幼苗相對(duì)蒸騰速率的影響

蒸騰作用是植株吸收水分的主要?jiǎng)恿χ?。蒸騰速率直接反應(yīng)了植株生物量的積累情況。各處理組初始的蒸騰速率都是100%，隨著鹽堿脅迫處理天數(shù)的增加，植株的蒸騰速率出現(xiàn)了急劇地下降，且隨著pH的增加，相對(duì)蒸騰速率的下降幅度愈大，且各處理組之間有顯著地差異（圖1）。

2.3 鹽堿脅迫對(duì)葉片葉綠素含量的影響

葉綠素作為重要的光合色素分子，參與光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，在光合作用中占有重要地位。植物受到逆境脅迫時(shí)，各種生理過程都會(huì)受到影響，從而直接或間接地影響到其含量［14］。由于各處理的黑麥草幼苗的葉片出現(xiàn)了很大程度的失水現(xiàn)象，所以數(shù)據(jù)處理時(shí)葉綠素的含量按各處理葉片含水量的大小換算成干重后得來。

與對(duì)照相比，各處理的葉綠素a（Chl a）含量顯著降低。當(dāng)pH＝9.1，pH＝9.9和pH＝10.9時(shí)，葉片葉綠素b（Chl b）的含量也有顯著降低。各處理的葉綠素總量（Chl a＋b）顯著低于對(duì)照的2.0mg／g DW，而后3組處理之間的差異并不顯著（表2）。

2.4 鹽堿脅迫對(duì)抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量及丙二醛含量的影響

圖1 pH值對(duì)多年生黑麥草幼苗相對(duì)蒸騰速率的影響Fig.1 Effects of pH on the relative transpiration rate of ryegrass seedlings

表2 不同pH值下蘇打鹽堿脅迫對(duì)多年生黑麥草幼苗葉綠素含量的影響Table 2 Effects of pH on the content of chlorophyll of ryegrass seedlings

2 4.1 對(duì)葉片SOD活性的影響 SOD是植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能清除細(xì)胞中多余的超氧根陰離子，其活性的高低變化反映了植物對(duì)氧化損傷的修復(fù)能力［15］。隨著堿脅迫pH的遞增，SOD的活性呈先上升后下降的現(xiàn)象，當(dāng)pH＜9.1時(shí)，SOD的活性逐步升高，當(dāng)pH＝9.1時(shí)SOD的活性最高，但與對(duì)照差異不顯著。當(dāng)pH＞9.1時(shí)，SOD的活性又開始下降，當(dāng)pH＝9.9時(shí)，基本與對(duì)照相等，pH＝10.9時(shí)，SOD的活性只有5.4U／mg蛋白，與對(duì)照相比顯著降低（表3）。

2.4.2 對(duì)葉片CAT活性的影響 CAT主要分布于過氧化物酶體中，能有效地降低植物體內(nèi)的過氧化氫對(duì)細(xì)胞的氧化作用［16］。因此，植物體內(nèi)存在CAT是其保護(hù)自身免受活性氧自由基毒害的關(guān)鍵因素之一。當(dāng)pH＝8.2時(shí)，CAT的活性與對(duì)照相比雖然有所降低，但是差異并不顯著。隨著pH的逐步升高，CAT的活性呈現(xiàn)逐步遞減的趨勢(shì)。在pH 8.2～9.1，CAT活性出現(xiàn)了急劇下降，但是差異并不顯著；pH＝9.9的處理與對(duì)照相比，CAT的活性有顯著降低，但與pH＝9.1和pH＝10.9兩組處理相比，差異都不顯著（表3）。

2.4.3 對(duì)葉片POD活性的影響 POD可清除植物體內(nèi)SOD催化反應(yīng)的產(chǎn)物H2O2，從而使需氧生物體免受H2O2的毒害［14］。當(dāng)pH＝8.2時(shí)，POD活性與對(duì)照相比雖然有所升高，但是差異并不顯著，其他3組處理與對(duì)照組相比都顯著升高。隨著pH的升高，POD的活性逐漸升高，但是pH＝8.2和pH＝9.1兩組之間的差異不顯著，pH＝9.1和pH＝9.9之間的差異也不顯著。最終POD活性增加慢慢趨于平緩以至于不再增加，pH＝9.9和pH＝10.9兩組的POD活性相等（表3）。

表3 pH值對(duì)多年生黑麥草葉片中抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量和丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of pH on the activities of SOD，POD，CAT，the contents of soluble protein and malonaldehyde in the leaves of ryegrass seedlings

2.4.4 對(duì)葉片中可溶性蛋白含量的影響 植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，其含量是了解植物體總代謝水平的一個(gè)重要指標(biāo)［17］。植物體可以通過增加可溶性蛋白的含量，提高滲透調(diào)節(jié)能力，增強(qiáng)對(duì)鹽堿脅迫的適應(yīng)能力［18］；高含量的可溶性蛋白可幫助維持植物細(xì)胞較低的滲透勢(shì)，抵抗水分脅迫導(dǎo)致的傷害，抗旱性強(qiáng)的植物種或品種的可溶性蛋白含量較高［19］。隨著pH的升高，黑麥草葉片中的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH≤9.9時(shí)，可溶性蛋白的含量逐漸升高至穩(wěn)定，但是隨著堿脅迫程度的進(jìn)一步加深，可溶性蛋白的含量又顯著下降（表3）。

2.4.5 對(duì)葉片中MDA含量的影響 正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除之間保持著一種動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)植物遭受脅迫時(shí)，這種平衡就被破壞，首先影響的是生物膜［20］。往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（malonaldehyde，MDA）是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，其含量與細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害程度密切相關(guān)［21］。MDA的含量愈高，脂質(zhì)過氧化作用愈強(qiáng)。隨著pH的升高，鹽堿脅迫都可以造成黑麥草細(xì)胞中MDA含量的逐步增加。在pH 8.2～9.1時(shí)，MDA含量的增長(zhǎng)幅度較大，而后，增加又相對(duì)平緩（表3）。

3 討論

3.1 鹽堿脅迫對(duì)多年生黑麥草生長(zhǎng)發(fā)育的影響

在蘇打堿脅迫下，多年生黑麥草的發(fā)育明顯遲緩。生長(zhǎng)抑制是植物響應(yīng)鹽漬生境最敏感的生理過程，當(dāng)植物被轉(zhuǎn)移到鹽堿逆境中幾分鐘后，生長(zhǎng)速度即有所下降。首先，在堿脅迫下，多年生黑麥草幼苗的相對(duì)蒸騰速率的降低，表明植株在生長(zhǎng)期全部的生命活動(dòng)受到了抑制，根系吸水與冠部蒸騰之間的平衡被打破，進(jìn)而植株體內(nèi)的各種代謝循環(huán)以及物質(zhì)和能量的傳遞和轉(zhuǎn)換受到了嚴(yán)重影響，生物量的積累自然而然地下降。直接從外觀上看，植株萎蔫失水嚴(yán)重，植物葉片含水量的變化一定程度上反應(yīng)了植株的耐鹽能力和保水能力，含水量變化越小，其保水能力和耐鹽能力越強(qiáng)［22］。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以得出，黑麥草幼苗的地上部和地下部的含水量都顯著的下降。而且，根和莖長(zhǎng)度都有顯著的降低，且根冠比隨著溶液pH的升高先增后減，反映出堿脅迫對(duì)根生長(zhǎng)的抑制程度明顯大于對(duì)莖生長(zhǎng)的抑制程度，表明根對(duì)生境周圍的pH值的變化更加敏感。

3.2 鹽堿脅迫對(duì)多年生黑麥草幼苗光合作用的抑制

葉綠素是決定植物光合能力的關(guān)鍵指標(biāo)，其含量的變化可以反映出光合生產(chǎn)的變化和脅迫因子對(duì)植物的作用程度。楊福等［23］在水稻（Oryza sativa）上發(fā)現(xiàn)非鹽堿土和蘇打鹽堿土中生長(zhǎng)的水稻劍葉光合作用日變化的趨勢(shì)，顯示鹽堿脅迫使每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和細(xì)胞間二氧化碳濃度顯著降低，亦表明同一光強(qiáng)下，蘇打鹽堿脅迫是導(dǎo)致植物光合作用下降的主要原因。隨著脅迫強(qiáng)度的增大，作為多年生黑麥草捕獲光能、驅(qū)使光合固碳的主要物質(zhì)——葉綠素含量下降（表2）。在正常條件下，葉綠素與葉綠體蛋白結(jié)合的松緊取決于細(xì)胞內(nèi)離子含量。這在蘇打堿脅迫條件下，黑麥草體內(nèi)的Na＋／K＋升高［24］，多余的鈉離子使葉綠素與葉綠體蛋白結(jié)合變松，更多的葉綠素遭到破壞，導(dǎo)致光合作用降低［25］，而影響黑麥草的生長(zhǎng)。此外，還可能因?yàn)槊{迫強(qiáng)度的進(jìn)一步增加，葉片葉綠體數(shù)目逐漸減少，類囊體松散扭曲、破裂并逐漸解體，所以導(dǎo)致葉綠素含量下降［26］。葉綠素含量的降低阻礙了葉片對(duì)碳的吸收和固定，而作為骨架元素碳的減少，又使黑麥草的生物量降低。

3.3 鹽堿脅迫對(duì)多年生黑麥草幼苗生理生化反應(yīng)的影響

因鹽脅迫對(duì)一系列代謝活性的滲透方面的影響，最終導(dǎo)致缺水，這種缺水會(huì)導(dǎo)致氧化脅迫。活性氧做為高滲透和離子脅迫的副產(chǎn)物，能夠?qū)е履すδ艿膯适Ш图?xì)胞死亡［27］。MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，它可與膜蛋白結(jié)合引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚合，類囊體膨脹變形、排列順序改變，造成基粒消失等葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化［28］。MDA還能使膜透性增大，又可與細(xì)胞內(nèi)的各種成分發(fā)生反應(yīng)，使膜系統(tǒng)中多種酶的生理功能嚴(yán)重?fù)p傷，因此，可用MDA含量來代表植物膜脂過氧化的水平，反映植物受傷害的程度?；钚匝踝杂苫倪^量積累直接導(dǎo)致膜脂過氧化，SOD、POD、CAT都可清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基，也有研究發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)最重要的保護(hù)酶［29，30］。本研究表明，MDA的含量在pH＝8.2時(shí)已經(jīng)有了顯著的增加，表明此環(huán)境下活性氧離子的積累較多。隨著脅迫程度的增強(qiáng)，MDA的含量也隨著增加。一方面，為了清除多余的活性氧，植株的抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生改變致力于維持活性氧的代謝平衡。SOD和POD活性的升高，可以高效地去除細(xì)胞內(nèi)的一些自由基。另一方面，隨著pH的升高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)能夠誘導(dǎo)活性氧過多積累，生物體內(nèi)活性氧的大量積累會(huì)造成細(xì)胞代謝紊亂，細(xì)胞質(zhì)膜嚴(yán)重受損，植株體內(nèi)MDA水平越來越高，抗氧化酶系統(tǒng)繼續(xù)被激活，試圖通過抗氧化酶活性的升高來清除過多的自由基，但是當(dāng)自由基積累到一定的量后，膜脂嚴(yán)重受損，機(jī)體內(nèi)許多蛋白合成受阻，SOD的基因表達(dá)也受到影響，SOD活性開始降低［31］。

干旱、鹽堿、低溫等外界逆境因子實(shí)質(zhì)上是一種體外信號(hào)，當(dāng)植物感知體外信號(hào)后，可以引發(fā)一系列的體內(nèi)信號(hào)，進(jìn)而誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的改變。在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，植物擁有完整的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)用以調(diào)節(jié)各種環(huán)境脅迫引起的響應(yīng)。所以，黑麥草對(duì)蘇打堿脅迫的適應(yīng)性應(yīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的動(dòng)態(tài)生理生化過程，其生長(zhǎng)指標(biāo)的變化和生理反應(yīng)的變化等都是緊密聯(lián)系在一起的，是綜合性的反應(yīng)，其確切的耐鹽堿機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。而且黑麥草是一種多年生牧草，它的耐堿能力可以逐漸訓(xùn)練出來。本實(shí)驗(yàn)只是從生長(zhǎng)和生理指標(biāo)方面探討了蘇打堿對(duì)黑麥草幼苗的影響，還應(yīng)進(jìn)一步探討鹽堿對(duì)黑麥草不同生長(zhǎng)時(shí)期的生理影響。

［1］ 王學(xué)文，藺彩虹，李小峰，等.NaHCO3脅迫對(duì)大葉紫花苜蓿生理特征的影響［J］.草業(yè)科學(xué)，2007，24（2）：26－29.

［2］ Zhu J K.Plant salt tolerance［J］.Trends Plants Science，2001，6（2）：66－71.

［3］ 元曲剛，趙可夫.氯化鈉和碳酸鈉對(duì)玉米生長(zhǎng)和生理脅迫效應(yīng)的比較研究［J］.作物學(xué)報(bào)，2004，30（4）：334－341.

［4］ Shalata A，Tal M.The effect of salt stress on lipid peroxidation and antioxidants in the leaf of the cultivated tomato and its wild salt－tolerant relative Lycopersicon pennellii［J］.Physiology Plant，1998，104（2）：169－174.

［5］ Sreenivasulu N，Grimm B，Wobus U，et al.Differential response of antioxidants to salinity stress in salt－tolerant and salt－sensitive seedlings of foxtail millet（Setariaitalica）［J］.Physiology Plant，2000，109（4）：435－442.

［6］ Asish K P，Anath B D.Salt tolerance and salinity effects on plants［J］.Eco－toxicology and Environmental Safety，2005，60（3）：324－349.

［7］ 劉友良，汪良駒.植物對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)和耐鹽性［A］.見：余叔文，湯章城.植物生理和分子生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1998：752－769.

［8］ Giannopolitis C N，Ries S K.Superoxide dismutase：I.Occurrence in higher plants［J］.Plant Physiology，1977，59（2）：309－314.

［9］ 張振霞，劉萍，楊中.25個(gè)多年生黑麥草品種萌發(fā)期對(duì)鹽脅迫的抗性研究［J］.草業(yè)科學(xué)，2007，24（2）：14－18.

［10］ Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein－dye Binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72（1－2）：248－254.

［11］ Zhang J X，Kirkham M B.Drought－stress－induced changes in activities of superoxide dismutase，catalase，and peroxidase in wheat species［J］.Plant Cell Physiology，1994，35（5）：785－791.

［12］ Chance B，Maehly A C.Assay of catalase and peroxidase［A］.In：Colowick S P，Kaplan N O.Methods in Enzymology［M］.New York：Academic Press，1955：764－775.

［13］ Wang Z L，Huang B R.Physiological recovery of Kentucky bluegrass from simultaneous drought and heat stress［J］.Crop Science，2004，44（5）：1729－1736.

［14］ 吳成龍，尹金來，徐陽(yáng)春，等.堿脅迫對(duì)菊芋幼苗生長(zhǎng)及其光和作用和抗氧化作用的影響［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2006，26（3）：447－454.

［15］ 張敏，王較常，嚴(yán)蔚東，等.鹽脅迫下轉(zhuǎn)Bt基因棉的K＋、Na＋轉(zhuǎn)運(yùn)及SOD活性的變化［J］.土壤學(xué)報(bào)，2005，42（3）：460－467.

［16］ 劉琛，丁能飛，傅慶林，等.鹽脅迫對(duì)3種蔬菜幼苗抗氧化酶活性的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，38（1）：115－116.

［17］ 劉惠芬，高玉葆，張強(qiáng)，等.不同種群羊草幼苗對(duì)土壤干旱脅迫的生理生態(tài)適應(yīng)［J］.南開大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，12（4）：105－110.

［18］ 譚巍巍，李鳳山，張玉霞，等.氯化鈉和碳酸鈉對(duì)蘆筍的脅迫效應(yīng)比較［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（7）：322－325.

［19］ 羅群，唐自慧，李路娥，等.干旱脅迫對(duì)9種菊科雜草可溶性蛋白質(zhì)的影響［J］.四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，29（3）：356－359.

［20］ 馮建永，龐民好，張金林，等.復(fù)雜鹽堿對(duì)黃頂菊種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響及機(jī)理初探［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（5）：77－86.

［21］ Zhang E P，Zhang S H，Si L T，et al.Effects of NaCl stress on the membranes lipid per oxidation in cotyledon of cucumber seedlings［J］.Journal of Shengyang Agricultural University，2001，32（6）：446－448.

［22］ 孟林，尚春燕，毛培春，等.偃麥草屬植物種質(zhì)材料苗期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（4）：67－74.

［23］ 楊福，梁正偉，王志春，等.蘇打鹽堿脅迫下水稻凈光合速率日變化及其與影響因子的關(guān)系［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，2007，21（4）：386－390.

［24］ 黃立華，梁正偉.直播羊草在不同pH土壤環(huán)境下的離子吸收特性［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2008，30（1）：35－39.

［25］ 趙可夫.植物抗鹽生理［M］.北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1993：222－223.

［26］ 柯玉琴，潘延國(guó).NaCl脅迫下對(duì)甘薯葉片葉綠素超微結(jié)構(gòu)及一些酶活性的影響［J］.植物生理學(xué)報(bào)，1999，25（4）：229－233.

［27］ Bohnert H J，Richard G J.Strategies for engineering water stress tolerance in plants［J］.Trends Biotechnology，1996，14（3）：89－97.

［28］ 張永峰，殷波.混合鹽堿脅迫對(duì)苗期紫花苜?？寡趸富钚约氨┖康挠绊懀跩］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（1）：46－50.

［29］ 龔吉蕊，張新，趙愛芬，等.油蒿抗旱生理生化特性研究初報(bào)［J］.中國(guó)沙漠，2002，22（4）：387－392.

［30］ 張玉霞，譚巍巍，王樹艷，等.鹽堿脅迫對(duì)蘆筍抗氧化酶活性的影響［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，21（2）：165－168.

［31］ 金美芳，連陽(yáng)梅，林炎鴻.NaCl脅迫對(duì)油菜幼苗膜脂過氧化和抗氧化酶活性的影響［J］.福建師范大學(xué)福清分校學(xué)報(bào)，2009，91（2）：16－20.