劉曙娜，于林清，周延林，吉仁花，陳世茹，孫娟娟，么婷婷

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010021；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010019；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010019；5.東北師范大學(xué)植被生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春130024）

苜蓿（Medicago）屬豆科多年生草本植物，是世界上分布、栽培面積廣，適應(yīng)性廣泛，品質(zhì)優(yōu)良的牧草。具有產(chǎn)草量高、品質(zhì)優(yōu)良、適口性好的特點(diǎn)，有很高的農(nóng)業(yè)價值和商業(yè)價值。由于栽培苜蓿的同源四倍體特性使得其連鎖圖譜的構(gòu)建相對困難。目前，公認(rèn)的已發(fā)表四倍體苜蓿連鎖圖共有3個，Brouwer和Osborn［1］利用2個回交群體各101株個體，以單劑量位點(diǎn)（SDAs）方法將88個RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性）標(biāo)記構(gòu)成7個連鎖群，總遺傳距離為443cM，飽和度相對較低。Julier等［2］利用168個F1雜交重組群體構(gòu)建了遺傳距離為2 649cM的父本連鎖圖譜和遺傳距離為3 045cM的母本連鎖圖譜，同時利用SSR（simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列）標(biāo)記構(gòu)建了遺傳距離為709cM 的整合圖譜。Musical等［3］利用 AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）和 RAPD（random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性）標(biāo)記構(gòu)建了四倍體苜蓿遺傳圖譜。Eujayl等［4］于2005年利用來自紫花苜蓿（M.sativa）×黃花苜蓿（M.falcata）的F1回交群體，以EST（expressed sequence tag，表達(dá)序列標(biāo)簽）－SSR、SSR（SSR的分子標(biāo)記代替首例圖譜中的88個RFLP）構(gòu)建了比較飽滿的遺傳圖譜，總遺傳距離為624cM。構(gòu)建苜蓿分子遺傳圖譜可以進(jìn)行目的基因的連鎖分析、定位重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因位點(diǎn)（QTL）及分子標(biāo)記輔助育種（molecular marker assisted selection，MAS）［5］。由于苜蓿遺傳圖譜共享機(jī)制不完善和我國苜蓿種質(zhì)資源群體的獨(dú)特性，構(gòu)建擁有自主產(chǎn)權(quán)的苜蓿遺傳圖譜成為首要任務(wù)。但是，目前國內(nèi)尚未構(gòu)建出一套完整的四倍體苜蓿遺傳連鎖圖譜。魏臻武［6］利用SSR、ISSR（inter－simple sequence repeat）和 RAPD技術(shù)構(gòu)建了苜蓿的指紋圖譜。

本研究以篩選出的高抗（抗寒——秋眠級為1）黃花苜蓿與高產(chǎn)（每年產(chǎn)量——鮮重6.45kg／m2）［7］紫花苜蓿雜交產(chǎn)生F1代個體，并且由F1代個體自交構(gòu)建F2群體。對F1的親本紫花、黃花苜蓿和F2個體DNA樣本分別進(jìn)行RAPD［8］分子標(biāo)記的遺傳作圖研究。旨在優(yōu)化苜蓿分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)體系，構(gòu)建苜蓿遺傳連鎖框架圖，為進(jìn)一步構(gòu)建飽和的苜蓿遺傳連鎖圖譜及開展苜蓿分子育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2007年選擇早期收集的黃花苜蓿與紫花苜蓿的特殊類型遺傳材料，包括國內(nèi)、美國農(nóng)業(yè)部和俄羅斯共計(jì)25份材料（均為2代以上選育的四倍體材料）。對所選的18份紫花苜蓿、7份黃花苜蓿進(jìn)行正、反交產(chǎn)生了大量的F1代。2008年春在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所呼和浩特市南郊實(shí)驗(yàn)場對雜交成功的F1育苗并人工套袋自交，于2009年建立了F2群體。2010年對雜交成功的94個單株雜交子代進(jìn)行形態(tài)與農(nóng)藝指標(biāo)的檢測。

1.2 DNA提取與純化

1.2.1 基因組DNA提取 對苜蓿親本（本研究中均為高產(chǎn)紫花苜蓿、高抗黃花苜蓿）、F1和F2代個體葉片分別進(jìn)行取樣，并存儲于－80℃的超低溫冰箱中待用。本實(shí)驗(yàn)采用植物基因組提取試劑盒（由上海生物工程有限公司提供）進(jìn)行DNA提取。

1.2.2 基因組DNA檢測 紫外分光光度法測定DNA的濃度、純度，計(jì)算樣品濃度：DNA濃度（μg／μL）＝OD260×N×50／1000［9］，式中，OD260為核酸吸光度，N 為樣品稀釋倍數(shù)。

電泳檢測DNA：將提取的DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠（含GoodView核酸染料）上電泳，檢測其完整性和片斷大小。

1.3 RAPD實(shí)驗(yàn)體系

反應(yīng)在96孔PCR板上進(jìn)行，總體積為20μL，其中包括模板DNA 1μL（大約20ng）；50μmol／L的引物1 μL；2×Taq Master Mix 10μL；ddH2O 8μL。擴(kuò)增條件為94℃下預(yù)變性3min；進(jìn)入循環(huán)，94℃下變性30s；36℃下復(fù)性30s；72℃下延伸60s，共40個循環(huán)；最后在72℃下延伸10min，結(jié)束后于4℃下保存。

擴(kuò)增結(jié)束后，取下樣品，在制備好的1.5%瓊脂糖膠（含GoodView核酸染料）上點(diǎn)樣。在1×TBE電泳緩沖液中電泳，功率為100W。電泳時間為45min。電泳結(jié)束后取出膠在UVI凝膠成像系統(tǒng)（英國UVI公司Fire－Reader系列）下觀察、拍照記錄。

實(shí)驗(yàn)用于RAPD的隨機(jī)引物共192個，購自上海Sangon公司。

1.4 苜蓿RAPD引物篩選

用F1親本及隨機(jī)抽取的F2個體的DNA樣品篩選在親本中呈多態(tài)性而在子代中呈分離的擴(kuò)增譜帶的引物。

1.5 RAPD擴(kuò)增作圖及數(shù)據(jù)采集

利用篩選的引物對包括F1的親本、F1及F2個體共97個樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。記錄在親本中存在多態(tài)性而在F2代個體中發(fā)生分離的譜帶，某一譜帶出現(xiàn)的個體在該位點(diǎn)的基因型記作“1”；該譜帶不出現(xiàn)的個體在該位點(diǎn)的基因型記作“0”；有些帶型不易確定連同缺失的個體，一同按缺失數(shù)據(jù)處理記作“－”。按通用格式將所有數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)保存成文本文件備用。

1.6 RAPD標(biāo)記的分離檢測、連鎖分析與圖譜構(gòu)建

將原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換成符合 MAPMAKER 3.0（For PC）作圖軟件中要求的作圖數(shù)據(jù)文件，然后采用MAPMAKER 3.0軟件并結(jié)合JionMap 4.0軟件在計(jì)算機(jī)上構(gòu)建連鎖圖譜［10］。通過兩點(diǎn)連鎖分析，計(jì)算所有成對座位的重組率和最大LOD值，推測可能的連鎖群。根據(jù)需要，不同的連鎖群可以定義不同的LOD值，以達(dá)到最佳的分群效果。然后對每個連鎖群中的標(biāo)記作多點(diǎn)分析，并采用Kosambi函數(shù)，將重組率轉(zhuǎn)換成圖距單位——厘摩（centimorgan，cM）。分析模型選用自交（F2）類型。經(jīng)過連鎖分析，最后得到連鎖框架圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD引物篩選

用親本DNA和F2代個體DNA對192個隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，共獲得在親本中呈多態(tài)性，在F2代個體中有分離的隨機(jī)引物72個，有120個引物（占62.50%）沒有檢測出多態(tài)性標(biāo)記。引物入選率為37.50%。

2.2 親本的多態(tài)性檢測

從隨機(jī)引物篩選的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有37.50%的引物揭示了親本間的遺傳多態(tài)性，表明兩親本在基因組水平上存在一定的差異。

2.3 RAPD標(biāo)記分析

用篩選的72個引物對F1雙親、F1及94個F2群體樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增（圖1），共記錄了74個RAPD標(biāo)記的分離。F2中多態(tài)分離標(biāo)記來自母本黃花苜蓿的有29個（占39.19%），來自父本紫花苜蓿的有45個（占60.81%），表明F2群體基本上分別來自雙親的50%，略偏父本。

參與連鎖分析的RAPD分子標(biāo)記共計(jì)74個。其中，51個標(biāo)記位點(diǎn)分別定位在8個連鎖群上（表1），覆蓋長度為1 261.5cM，平均標(biāo)記數(shù)為6.38個，2個標(biāo)記間平均圖距為24.73cM，另有23個標(biāo)記未與這8個連鎖群連鎖。標(biāo)記位點(diǎn)較多的連鎖群為LG1、LG2、LG3和LG8，分別包含18，8，5和5個標(biāo)記，標(biāo)記數(shù)最少的連鎖群只有3個標(biāo)記。連鎖群LG1遺傳距離最長，為461.2cM，遺傳距離最短的為51.3cM，平均圖距最大的連鎖群為LG3，間距為38.16cM，平均圖距最小的連鎖群為LG4，間距為14.23cM。來源于紫花苜蓿的45個多態(tài)RAPD標(biāo)記中有32個標(biāo)記被分配到8個連鎖群上，占43.24%。有13個標(biāo)記未被連鎖到任何一個連鎖群上；來源于黃花苜蓿的29個多態(tài)RAPD標(biāo)記中有19個標(biāo)記被分配到8個連鎖群上，占25.68%。有10個標(biāo)記未被連鎖到任何一個連鎖群上。

圖1 S1013對親本及個別F2個體DNA電泳圖Fig.1 PCR amplification patterns by primer S1013in parents and F2

2.4 連鎖分析與圖譜構(gòu)建

通過對每個連鎖群中的標(biāo)記作多點(diǎn)分析，并將重組率轉(zhuǎn)換成圖距單位（cM）。經(jīng)過連鎖分析，共得到8條連鎖群（圖2），其中，每條連鎖群左側(cè)給出了2個標(biāo)記位點(diǎn)間的圖距（cM），右側(cè)給出了呈多態(tài)性的標(biāo)記名稱。

由于作圖軟件的局限性和總標(biāo)記數(shù)目太少，本研究所獲得的連鎖標(biāo)記不多。隨著實(shí)驗(yàn)條件的逐步完善，可以預(yù)期，隨著標(biāo)記數(shù)目的增加，連鎖標(biāo)記會越來越多，遺傳圖譜越來越密集。

本研究中，定位到圖譜上的分離標(biāo)記共51個，來自于49個RAPD引物（表2）。其中，引物L(fēng)16、S43均有2個分離標(biāo)記。

表1 分子標(biāo)記在各連鎖群的分布情況Table 1 Molecular marker in the distribution of a linkage groups

3 討論

本研究以F2群體作為作圖群體，利用RAPD技術(shù)構(gòu)建了四倍體苜蓿的遺傳圖譜。以期為苜蓿遺傳育種工作提供參考與基礎(chǔ)材料。

建立一個完善的遺傳作圖群體直接關(guān)系到圖譜構(gòu)建的質(zhì)量高低。由于苜蓿自身的細(xì)胞學(xué)特性、遺傳研究水平和現(xiàn)有構(gòu)圖技術(shù)限制，在短時間內(nèi)不可能像農(nóng)作物那樣建立高世代作圖群體。目前真正比較理想的作圖群體比較少，對親本的一些基本信息還了解不多，在作圖中將會帶來很多問題［2］。用于苜蓿遺傳圖譜構(gòu)建的作圖群體，主要有下列幾種類型：F2群體、回交群體、F1群體等。在國外，目前公布的3個四倍體苜蓿圖譜中的作圖群體分別是回交群體（BC1為基礎(chǔ)）［1］和F1雜交重組群體［2，4］。在國內(nèi)，張麗芳［11］以2個差異較大的蒺藜苜蓿親本W(wǎng)5160和Jemalong進(jìn)行雜交，獲得雜交組合W5160×Jemalong，進(jìn)而構(gòu)建了蒺藜苜蓿的F2群體。目前國內(nèi)還未見關(guān)于四倍體栽培苜蓿群體構(gòu)建的報(bào)道，今后有必要加強(qiáng)相關(guān)的研究［12］。而在構(gòu)建遺傳圖譜中采用的分子標(biāo)記主要包括RFLP、RAPD、AFLP、STS（sequence tagged sites，序列標(biāo)志位點(diǎn)）、SSR 等。各種方法均各具優(yōu)缺點(diǎn)。RAPD技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種可對整個未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子標(biāo)記技術(shù)［13］。相比之下，RAPD技術(shù)方法簡便、高效、成本低，得到了廣泛的應(yīng)用。目前已被分子遺傳學(xué)家應(yīng)用到各個學(xué)科、領(lǐng)域，如品種鑒定［14－16］、遺傳多樣性分析［17－20］、遺傳連鎖分析和基因定位、分子標(biāo)記輔助育種［21］等。目前已發(fā)表的多個苜蓿圖譜由于材料與所選分子標(biāo)記的不同還不能重合。隨著各種遺傳標(biāo)記方法的逐步完善和發(fā)展，目前已經(jīng)進(jìn)入綜合應(yīng)用各種遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因組研究的新階段。作圖群體的大小直接影響到作圖的精度和應(yīng)用范圍。從已發(fā)表的圖譜來看，大多數(shù)所采用的群體樣本數(shù)在100以內(nèi)，少數(shù)研究者采用300個以上。本研究中采用了94個樣本可檢測到的重組最小圖距為3.2cM，表明在樣本數(shù)量上可以滿足構(gòu)建連鎖框架圖的需要。本研究在構(gòu)建遺傳圖譜時選擇了 MAPMAKER／EXP（3.0）與JionMap 4.0軟件來進(jìn)行分群，MAPMAKER／EXP（3.0）在作物、蔬菜中已被廣泛應(yīng)用，但在牧草中還尚未廣泛應(yīng)用。分群過程中可以根據(jù)分群效果選用適宜的LOD值，以期獲得最佳分群效果。

圖2 苜蓿連鎖框架圖Fig.2 RAPD map of tetraploid alfalfa

表2 49個RAPD引物序列Table 2 Sequences of 49RAPD primers

由于在過去缺乏對苜蓿經(jīng)典遺傳學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)等方面的研究，目前大多數(shù)已構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜僅僅是一個框架圖，大都沒有和染色體相對應(yīng)，構(gòu)建的圖譜離應(yīng)用還有一段距離；因此在今后的一段時間內(nèi)，在開展分子標(biāo)記研究的同時必須加強(qiáng)一些基礎(chǔ)研究。

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