李玉坤，王學(xué)敏，王贊，李俊，Vladimir C，Nikolay D，孫桂枝，高洪文＊

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.俄羅斯瓦維洛夫全俄植物栽培研究所，圣彼得堡190000）

干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫嚴(yán)重影響了植物的生存和產(chǎn)量，它們均可造成植物細(xì)胞缺水，產(chǎn)生干旱信號(hào)，誘導(dǎo)植物的抗旱反應(yīng)。晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白（late embryogenesis abundant protein，LEA）是一種脫水保護(hù)劑，能夠在水分脅迫下保護(hù)生物大分子。LEA蛋白可分為許多不同的家族［1，2］，脫水蛋白（dehydrin，DHN）屬于LEAⅡ或LEA D－11蛋白家族［2］。DHN可在胚胎發(fā)生晚期或者在干旱、低溫、鹽脅迫和ABA的誘導(dǎo)下表達(dá)［3］。脫水蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)保守性強(qiáng)，具有K，S和Y等3個(gè)高度保守區(qū)域，通常以YSK的順序結(jié)合在一起［3］。Y片段為（V／T）DEYGNP，位于N末端。K片段（EKKGIMDKIKEKLPG）由15個(gè)氨基酸組成。S片段是一個(gè)可磷酸化的絲氨酸簇，一般位于K片段之間，或緊跟K片段。高度極性的φ片段的存在增加了極性氨基酸片段的比例，加強(qiáng)了脫水蛋白結(jié)構(gòu)的親水性。由于K片段和φ片段的存在，脫水蛋白能夠通過形成一個(gè)保護(hù)層而保護(hù)變性的高分子，在各種組織中都起到穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用［3，4］。

Koag等［5］從玉米（Zea mays）中分離純化得到DHN1，證實(shí)在受到脅迫的植物中，脫水蛋白在穩(wěn)定液泡和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)中起到非常重要的作用。在水稻（Oryza sativa）中，已報(bào)道了多個(gè)脅迫誘導(dǎo)的脫水蛋白，其中RAB21／16A，RAB16B，16C，16D，RAB25和 WSI724已經(jīng)證實(shí)是滲透脅迫誘導(dǎo)的［6－9］。此外，LEA 蛋白在植物和酵母中超表達(dá)可以提高對(duì)滲透脅迫的抵抗力［10－12］。

東方山羊豆（Galega orientalis）作為一種新型優(yōu)良豆科牧草，在我國(guó)主要種植在西北地區(qū)。東方山羊豆品質(zhì)好、產(chǎn)量高、抗病抗逆性強(qiáng)、使用年限長(zhǎng)［13］，與其他牧草資源相比，東方山羊豆目前的相關(guān)研究較少［14］。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源研究室自2007年以來對(duì)引進(jìn)東方山羊豆的抗逆基因開展了研究，目前已經(jīng)取得一定進(jìn)展。李鑫等［15］從東方山羊豆中分離得到液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，推測(cè)該基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)可能是決定東方山羊豆耐鹽能力的重要因子。Chen等［16］克隆了東方山羊豆的RAV基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real－time PCR）分析表明，GoRAV 基因受外源脫落酸（abscisic acid，ABA）、干旱、低溫和鹽脅迫誘導(dǎo)，證明該基因在依賴ABA信號(hào)途徑的抗逆性調(diào)控中起到一定的作用。

目前，抗逆基因工程主要集中在逆境條件下表達(dá)的某些基因和抗逆代謝過程中某些酶的研究［17］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，克隆植物抗逆相關(guān)基因并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一些與抗性密切相關(guān)的外源目的基因?qū)肽繕?biāo)植物中來提高其抗逆性是解決逆境脅迫的一條有效途徑［18］。本研究首次從東方山羊豆中克隆DHN基因，初步探索了DHN基因在東方山羊豆抗逆性方面的作用，為深入研究該種牧草的抗逆機(jī)理，進(jìn)行抗逆性改良奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 東方山羊豆為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源研究室提供。

1.1.2 藥品與試劑 Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品，cDNA Synthesis Kit為Promega公司產(chǎn)品，SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit為 Clontech公司產(chǎn)品，克隆載體pMD18T、Taq酶、限制性內(nèi)切酶、Alkaline Phosphatase、T4DNA連接酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料的處理與總RNA的提取 于2009年7月開始植物材料的處理，首先將東方山羊豆的種子用氯氣消毒24h，播種于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，在光照培養(yǎng)箱（溫度為24℃，光照時(shí)間為12h／d）中培養(yǎng)至種子發(fā)芽。然后將發(fā)芽后的種子移至蛭石與珍珠巖比例為3∶1的花盆中繼續(xù)培養(yǎng)30d。幼苗用0.25mol／L NaCl溶液處理2，6，10h，Trizol法提取總RNA后用于克隆DHN 基因的全長(zhǎng)cDNA序列［19］。再用0.25mol／L NaCl溶液、20%PEG（聚乙二醇）溶液、0.1×10－3mol／L ABA溶液分別處理幼苗0，2，4，8，12和24h，分別提取總 RNA，用于 Real－time PCR分析。

1.2.2 DHN 基因3′末端序列、5′末端序列和全長(zhǎng)cDNA序列的克隆 用Trizol法分別提取0.25mol／L NaCl溶液處理2，6，10h后的幼葉總RNA后，按照質(zhì)量比為1∶1∶1混合，用混合RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源研究室通過構(gòu)建SSH cDNA文庫得到的DHN基因的EST序列，用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE特異性引物，3′RACE：GGTTATGGAACAACTGGGTATGGTGG；5′RACE：CCAGTGCTTCCAGTTCCACCATACCC。根據(jù) SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書分別PCR擴(kuò)增出3′末端和5′末端序列，分別測(cè)序后，結(jié)合EST序列用DNAMAN 5.0軟件拼接出全長(zhǎng)cDNA序列，找到開放閱讀框ORF，在ORF兩端分別設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，DHN－ORF－F：CAATGTCTCAGTATAATCAAGGTCA；DHN－ORF－R：AGAGATACTATATGATCTAGTGTCCAG。經(jīng) PCR 擴(kuò)增，測(cè)序后得到DHN基因全長(zhǎng)cDNA序列。

核酸及氨基酸序列分析、開放閱讀框ORF的查找和翻譯用DNAStar 6.13軟件進(jìn)行分析，利用ScanProsite服務(wù)器（http：／／www.expasy.org／tools／scanprosite／）對(duì) DHN蛋白進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。從 GeneBank上下載其他植物中的18種DHN蛋白，利用MEGA4軟件Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 Real－time PCR檢測(cè)DHN基因的組織表達(dá)特異性 分別提取東方山羊豆的根、莖、葉總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)東方山羊豆DHN基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物（預(yù)期擴(kuò)增片段大小為270bp），DHNRT－F：GGTCAATACGGTCAACAAACACG；DHN－RT－R：CACCTGTACCTGTCTGGGTTCC。以 Actin 基因做內(nèi)參，設(shè)計(jì)特異性引物（預(yù)期擴(kuò)增片段大小為200bp），Actin－RT－F：GGACAAGTTATCACCATCGG；Actin－RT－R：TCAGGAATACCTGGAAACATAG。參考TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書，使用 ABI PRISM 7500Real－time PCR System（ABI，USA），采用兩步法進(jìn)行 Real－time PCR擴(kuò)增，第1步：95℃預(yù)變性30s；第2步：95℃5s，60℃34s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)cDNA樣品做3次重復(fù)。

根據(jù)得到的Ct值，利用Kenneth和Thomas［20］報(bào)道的2－△△Ct方法，分別計(jì)算DHN基因在根、莖、葉中的表達(dá)量。把根中表達(dá)量設(shè)為對(duì)照，莖、葉分別設(shè)為2個(gè)不同處理，利用公式：

分別計(jì)算出根、莖、葉的2－△△Ct（表達(dá)水平）值，式中，CtTarget為目標(biāo)基因達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；CtActin為內(nèi)參基因達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；（CtTarget－CtActin）處理為處理樣品中目標(biāo)基因經(jīng)Actin校正后的循環(huán)數(shù)；（CtTarget－CtActin）對(duì)照為對(duì)照樣品中目標(biāo)基因經(jīng)Actin校正后的循環(huán)數(shù)；△△Ct為處理樣品中目標(biāo)基因與對(duì)照樣品中目標(biāo)基因循環(huán)數(shù)的差值。利用Excel繪出柱形圖。

1.2.4 Real－time PCR檢測(cè)DHN 基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)量 按照1.2.1中用于Real－time PCR分析的材料處理方法處理東方山羊豆幼苗，分別提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。同1.2.3的方法，進(jìn)行不同逆境脅迫下的表達(dá)量分析。每個(gè)cDNA樣品做3次重復(fù)。

將0h設(shè)為對(duì)照，2，4，8，12和24h分別設(shè)為5個(gè)不同處理，按照1.2.3的方法，分別計(jì)算出2－△△Ct值，利用Excel繪出柱形圖。

1.2.5 構(gòu)建植物表達(dá)載體 設(shè)計(jì)帶有BglII酶切位點(diǎn)的引物，DHN－F：GAAGATCTAATGTCTCAGTATAATCAAGGTC；DHN－R：GAAGATCTGTGTCCAGTACAAGATCCAG。以pMD18T－DHN重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的DHN基因的ORF。用BglII限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和pCAMBIA1302植物表達(dá)載體，對(duì)酶切后的p1302載體進(jìn)行去磷酸化后，用T4DNA連接酶4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布含有卡那霉素的LB（Luria－Bertani培養(yǎng)基）平板，經(jīng)抗生素篩選后挑菌，搖菌，抽提質(zhì)粒，經(jīng)BglII酶切鑒定為陽性克隆的，送北京三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHN基因全長(zhǎng)cDNA的克隆與分析

以東方山羊豆鹽脅迫cDNA為模板，分別利用3′RACE和5′RACE特異性引物擴(kuò)增出3′末端和5′末端片段，其中3′末端片段經(jīng)測(cè)序?yàn)?97bp（圖1A），5′末端片段經(jīng)測(cè)序?yàn)?13bp（圖1B）。利用DNAMAN 5.0軟件拼接后的全長(zhǎng)cDNA為1 169bp。利用DHN－ORF特異性引物，擴(kuò)增出全長(zhǎng)cDNA的ORF經(jīng)測(cè)序?yàn)?43bp（圖1C）。將該基因命名為GoDHN，NCBI登錄號(hào)為HM777019。

圖1 DHN基因的3′末端片段、5′末端片段和全長(zhǎng)ORF擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of 3′RACE，5′RACE and full－length ORF of DHNgene

圖2 DHN基因的核苷酸序列和氨基酸序列Fig.2 The nucleotide sequence and amino acid sequence of DHNgene

利用DNAStar 6.13軟件對(duì)DHN基因cDNA序列進(jìn)行分析，開放閱讀框編碼281個(gè)氨基酸，所編碼的蛋白質(zhì)分子量為28.71kDa。通過ScanProsite服務(wù)器對(duì)DHN蛋白的氨基酸序列分析，該氨基酸序列包含1個(gè)Y片段，3個(gè)K片段（圖2）。

用MEGA 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），分析結(jié)果顯示，GoDHN蛋白與豆科植物親緣關(guān)系較近，與禾本科和十字花科等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中與豌豆PsDHN蛋白親緣關(guān)系最近，其次是大豆GmMAT1和GmDHN5蛋白，均屬于YKn亞型，但與豆科植物紫花苜蓿MsCAS15A蛋白和大豆GmSRC1蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這2個(gè)蛋白屬于KnS亞型。

圖3 東方山羊豆DHN蛋白與其他植物中18種DHN蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree of dehydrins in G.orientalis and another eighteen plants

2.2 DHN基因的組織特異性表達(dá)分析

根據(jù)1.2.3中的公式，計(jì)算DHN基因在東方山羊豆不同組織中的相對(duì)表達(dá)量（圖4）。結(jié)果表明，GoDHN在根中表達(dá)量最少，莖中最多，葉中次之。以東方山羊豆根中DHN基因的表達(dá)量為對(duì)照，莖中的表達(dá)量為根中的6倍，葉中表達(dá)量為根中的5.5倍。

2.3 DHN基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)分析

根據(jù)1.2.4中的公式，計(jì)算了DHN基因在分別受到ABA、NaCl和PEG脅迫0，2，4，8，12和24 h的相對(duì)表達(dá)量（圖5）。結(jié)果顯示，DHN基因在ABA脅迫誘導(dǎo)下，4h時(shí)表達(dá)量達(dá)到一個(gè)小高峰，然后下降，在24h誘導(dǎo)后表達(dá)量猛增到4h表達(dá)量的2倍（圖5A）。在NaCl的脅迫誘導(dǎo)下，DHN基因的表達(dá)量逐步增加，在24h達(dá)到最高峰，為對(duì)照（0 h）的6 500倍（圖5B）。在PEG誘導(dǎo)12h后，DHN基因的表達(dá)量達(dá)到一個(gè)最高峰，為對(duì)照（0h）的42 000倍，誘導(dǎo)24h后，表達(dá)量相對(duì)12h時(shí)有所下降，但仍然是對(duì)照（0h）的35 000倍（圖5C）。

2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

用BglII限制性內(nèi)切酶分別酶切帶有BglII酶切位點(diǎn)的DHN基因ORF和pCAMBIA1302載體后，經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化，挑取菌落，抽提質(zhì)粒，經(jīng)BglII酶切鑒定，得到與預(yù)期大小一致的目的片段（圖6）。鑒定為陽性的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序序列完全正確，表明植物表達(dá)載體pCAMBIA1302－DHN構(gòu)建成功。

圖4 DHN基因在東方山羊豆的不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative expression of DHNgene in different tissues of G.orientalis

圖5 DHN基因在受到ABA、NaCl和PEG誘導(dǎo)后的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The relative expression of DHNgene induced by ABA，NaCl and PEG

3 討論

本研究得到的GoDHN基因的氨基酸序列中（圖2），在 N末端有一個(gè) Y片段（VDQYGNP），Close［3］認(rèn)為該片段的存在與DHN基因在植物和細(xì)菌中的核定位有關(guān)。在該氨基酸序列的中間部位和C末端包含有3個(gè) K片段（EE／D／KKGIMDKIKEKIPG），Soulages等［19］通過二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)證明K片段可能形成α螺旋結(jié)構(gòu)，參與脫水蛋白的親水或疏水作用。純化的玉米脫水蛋白G50中15%的氨基酸形成了α螺旋結(jié)構(gòu)，但G50中沒有任何疏水位點(diǎn)，卻能參與疏水作用，推測(cè)K片段形成的α螺旋結(jié)構(gòu)，賦予了G50參與疏水相互作用的潛力［21］。脫水蛋白通過K片段可能參與部分變性蛋白質(zhì)及膜的疏水相互作用來防止蛋白質(zhì)和膜進(jìn)一步變性［19］。在某些植物的脫水蛋白中，如擬南芥（Arabidopsisthaliana）RAB18，還含有一個(gè) S保守片段，S片段是一個(gè)可磷酸化的絲氨酸簇，該片段的磷酸化可能也與核定位信號(hào)有關(guān)，可以參與脫水蛋白的入核過程［3］。

圖6 酶切鑒定Fig.6 Indentification of enzyme digestion

通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），將脫水蛋白分為5類［4］。結(jié)果表明，屬于同一亞型的脫水蛋白親緣關(guān)系有的近有的遠(yuǎn)，如GoDHN蛋白與菠菜（Spinacia oleracea）SoCAP160蛋白雖然同屬于YKn亞型，但是親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；與豌豆（Pisum sativum）PsDHN蛋白親緣關(guān)系最近，而且同屬于YKn亞型。與擬南芥At－RAB18蛋白親緣關(guān)系雖然較近卻不屬于同一亞型。說明在脫水蛋白的進(jìn)化過程中，分離較晚的蛋白有可能進(jìn)化為不同的亞型，而較早分離的蛋白可能源于同一亞型，并且在進(jìn)化過程中，一直保持不變。

YKn亞型脫水蛋白是一類酸性蛋白，對(duì)這一類蛋白的抗性研究主要集中在干旱和冷害環(huán)境脅迫下，如大豆（Glycine max）Mat1編碼一個(gè)Y2K型脫水蛋白，主要由干旱脫水誘導(dǎo)產(chǎn)生，而在ABA誘導(dǎo)下并無明顯表達(dá)［22］。菠菜CAP160編碼一個(gè)YK型脫水蛋白，主要受低溫誘導(dǎo)，在轉(zhuǎn)基因煙草中的高效表達(dá)可以提高其抗寒性［23］。桃樹 （Prunus persica）PpDhn1編碼一個(gè)Y2K2型脫水蛋白，也在低溫誘導(dǎo)時(shí)大量表達(dá)［24］。以上結(jié)果表明大部分YK型脫水蛋白在抗旱和耐寒方面可能發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)增加了鹽脅迫方面的研究，通過模擬逆境處理后（圖5），GoDHN基因在NaCl、PEG和ABA脅迫條件下表達(dá)均上調(diào)，其中NaCl和PEG模擬的鹽脅迫和干旱環(huán)境，誘導(dǎo)GoDHN基因表達(dá)量成千上萬倍的提高，暗示GoDHN脫水蛋白與植物的抗鹽和抗旱性密切相關(guān)。ABA誘導(dǎo)GoDHN基因的表達(dá)量雖然低于NaCl和PEG，但是與對(duì)照相比仍然提高了200倍，表明外源激素ABA的存在也可以誘導(dǎo)脫水蛋白的表達(dá)量上調(diào)。

脫水蛋白參與細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)過程，可以提高植物的抗旱和抗鹽性［25］。向日葵（Helianthus annuus）脫水蛋白基因HaDhn1和HaDhn2在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄活性顯著高于供水條件的轉(zhuǎn)錄活性，耐旱品種累積的轉(zhuǎn)錄物明顯高于敏感品種，并且其累積量與耐旱品種芽細(xì)胞膨壓的維持和干旱的適應(yīng)性呈正相關(guān)［26］。樺樹（Betula platyphylla）脫水蛋白Peudhn1，在未脅迫的植株中僅有少量表達(dá)，而在PEG6000和NaCl處理后，該蛋白在根和葉中大量積累，并在復(fù)水后持續(xù)積累［27］。在模擬鹽脅迫下誘導(dǎo)24h后，GoDHN基因的表達(dá)量是對(duì)照的6 500倍，顯著高于對(duì)照；在模擬干旱脅迫下誘導(dǎo)12h后，GoDHN基因的表達(dá)量是對(duì)照的42 000倍，誘導(dǎo)24h后，表達(dá)量雖然有所下降，但仍然顯著高于對(duì)照（圖5）。GoDHN可能通過參與細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)過程，來提高東方山羊豆的抗旱耐鹽能力。而高強(qiáng)度的誘導(dǎo)表達(dá)可能暗示著東方山羊豆具有非常強(qiáng)的抗旱耐鹽能力。

構(gòu)建植物表達(dá)載體是有一定策略的，構(gòu)建載體時(shí)目的基因與載體的連接可分為同源粘末端的連接、平末端的連接、定向克隆、接頭連接和同聚物加尾連接等［28］。本研究中，為了消除載體自身連接，采用堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，CIAP）對(duì)載體進(jìn)行去磷酸化。最后得到植物表達(dá)載體的重組質(zhì)粒及菌株并通過酶切鑒定，確定連接正確。

目前對(duì)脫水蛋白的基因表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能的研究已取得了很大的進(jìn)展，但其具體的分子保護(hù)機(jī)制大多數(shù)只限于推測(cè)。例如，在逆境下脫水蛋白具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和保護(hù)蛋白質(zhì)的作用雖然已被普遍認(rèn)同，但其在植物體內(nèi)具體是怎樣發(fā)揮作用的并不清楚。尤其是在牧草領(lǐng)域，對(duì)于脫水蛋白的研究很少。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究東方山羊豆脫水蛋白在逆境條件下的表達(dá)調(diào)控規(guī)律和生理生化機(jī)制奠定了一定理論基礎(chǔ)，也為牧草抗逆性改良提供了候選基因。

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