張 娜，李書光，陳金龍，胡琳琳，沈志強(qiáng)

2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600

支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的最小微生物，能在細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖。目前支原體污染組織、細(xì)胞、疫苗的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，據(jù)統(tǒng)計(jì)，有36%～87%的細(xì)胞株被支原體污染［1－2］，其中豬鼻支原體、口腔支原體、精氨酸支原體、發(fā)酵支原體、萊氏無膽甾支原體占全部污染的98%［3］，其余的僅占2%。支原體污染嚴(yán)重時(shí)，宿主細(xì)胞特性發(fā)生變化，包括生長(zhǎng)特性、酶結(jié)構(gòu)、染色體及細(xì)胞膜成分并誘導(dǎo)細(xì)胞病變，影響細(xì)胞的功能和代謝［4］。因此，受支原體污染的細(xì)胞、組織等用于疫苗生產(chǎn)將產(chǎn)生不良后果。支原體檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)法、電鏡法、血清學(xué)方法以及核酸探針法等，但都存在著種種不足［5］，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用傳統(tǒng)培養(yǎng)和PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，綜合利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的精準(zhǔn)和PCR檢測(cè)方法的快速，大大提高了檢測(cè)效率，又不失其精準(zhǔn)度。

1 材料與方法

1.1 材料 雞滑液囊支原體和豬鼻支原體購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，Taq DNA 聚合酶、DL2000、p MD－18T均購自大連寶生生物工程有限公司，改良Frey氏液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基、支原體液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基均參照《中國(guó)獸藥典》制備。1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中報(bào)道的支原體基因序列及其他細(xì)菌基因序列就行同源性比對(duì)分析，設(shè)計(jì)合成4條引物，Z－1，Z－2，Z－J和Z－Z。Z－1和Z－2一對(duì)引物參考倪紅霞等［6］，在此基礎(chǔ)上補(bǔ)充2條下游引物Z－J和Z－Z，PCR擴(kuò)增片段大小為280 bp左右。

1.2.2 檢測(cè)樣品總DNA的提取 檢測(cè)樣品為本公司所生產(chǎn)的不同批號(hào)和來源的各種疫苗半成品、成品，細(xì)胞株，血清等。取樣品900μL，加入100μL 10%SDS和10μL protein K，55℃，水浴1 h后，酚氯仿抽提，沉淀用20μL滅菌水溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為25μL。10×PCR Buffer 2.5μL（Mg2＋），2.5 mmol/L d NTPs 2 μL，25μmol/L引物各1μL，模板2μL，Taq酶0.5 μL，補(bǔ)水至總體積為25μL；95℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后延伸10 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物做1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下分析擴(kuò)增效果。1.2.4 檢測(cè)樣品中陽性產(chǎn)物的克隆和序列分析

使用DNA凝膠回收試劑盒回收280bp的目的片段，將回收的DNA與p MD18－T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α。陽性克隆菌液送上海生工生物有限測(cè)序，分析污染支原體的種類。

1.2.5 培養(yǎng)法和PCR相結(jié)合檢測(cè)支原體污染方法的應(yīng)用 參照《中國(guó)獸藥典》檢驗(yàn)方案進(jìn)行培養(yǎng)法檢測(cè)支原體污染，同時(shí)樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)。判定標(biāo)準(zhǔn)如下：若PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性，判定生物制品為支原體感染；若PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性，依培養(yǎng)法的結(jié)果為判定依據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 支原體標(biāo)準(zhǔn)株的PCR鑒定結(jié)果 我們用該引物擴(kuò)增支原體標(biāo)準(zhǔn)株豬鼻支原體和雞滑液囊支原體，結(jié)果顯示，2種支原體在280 bp處均有特異性條帶（圖1）。將特異性產(chǎn)物回收、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，與豬鼻支原體和雞滑液囊支原體的核苷酸同源性為100%。

2.2 培養(yǎng)法和PCR相結(jié)合檢測(cè)支原體污染方法的應(yīng)用 共檢測(cè)生物制品樣品224份，判定為陽性的份數(shù)為25份。PCR陽性產(chǎn)物克隆、測(cè)序，結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析，我公司污染生物制品的主要是精氨酸支原體、口腔支原體和豬鼻支原體，為污染生物制品的常見支原體。

圖1 雞滑液囊支原體、豬鼻支原體的PCR擴(kuò)增結(jié)果M：Marker 2000；1：豬鼻支原體；2：雞毒支原體；3：空白對(duì)照Fig.1 The PCR results of Mycoplasma synoviae and Mycoplasma hyorhinisM：DL2000 Marker；1：Mycoplasma hyorhinis；2：Mycoplasma gallisepticum；3：Blank control

圖2 部分樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果1：空白對(duì)照；2－8：樣品；9：陽性對(duì)照Fig.2 PCR results of some samples1：Blank control；2－8：Samples；9：Positive control

3 討 論

Z－1，Z－2上下游引物由倪紅霞等設(shè)計(jì)合成，特異性、靈敏度均較高，理論上可檢測(cè)出近30種支原體，包括最常污染細(xì)胞的5種支原體，且對(duì)污染細(xì)胞的細(xì)菌無特異性，在此基礎(chǔ)上補(bǔ)充2條下游引物，使該方法檢測(cè)支原體的種類涵蓋常見的生物制品支原體污染種類及生產(chǎn)中的弱毒和強(qiáng)毒。用該方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法同步檢測(cè)血清、疫苗、細(xì)胞株等樣品224份，PCR檢測(cè)出陽性25份，陽性率為11.2%，培養(yǎng)法檢出陽性13份，陽性率為5.8%，這說明PCR方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)法靈敏、特異，且檢測(cè)時(shí)間大大縮短。

目前，支原體檢測(cè)方法比較多，最常用的是熒光染色法和培養(yǎng)法，熒光染色法具有檢驗(yàn)樣品的限制［7］，而且因背景熒光的存在，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。培養(yǎng)法作為檢測(cè)支原體污染的經(jīng)典方法，是其他各種檢驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)，具有不可替代性，但其也有自身的弱點(diǎn)，其檢驗(yàn)周期較長(zhǎng)，操作相對(duì)繁瑣。我們進(jìn)行檢測(cè)時(shí)將培養(yǎng)法和PCR方法同步進(jìn)行，為保證生物制品的純粹判定。該方案綜合利用PCR方法快捷和傳統(tǒng)培養(yǎng)法精準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)，提高支原體污染陽性樣品的檢出速度，保證支原體陰性樣品檢驗(yàn)的合格率，為各企事業(yè)單位的生物制品和細(xì)胞系支原體污染提供一個(gè)更為切實(shí)可行的方案。

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