張俊峰，周武，王濤

(1.湖北省新華醫(yī)院麻醉科，武漢430015;2.華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院，武漢430030)

缺血性腦血管病引起的學習記憶功能減退，不僅降低患者生活質量，威脅人類健康，而且給家庭和社會造成巨大的負擔。丙泊酚(propofol，Pro)是一種抗氧化藥，能拮抗活性氧導致的多種細胞損傷，具有一定的腦保護作用[1-2]。但其是否能抑制腦缺血-再灌注所致認知功能障礙尚未可知。神經生長因子(nerve growth factor，NGF)對缺血低氧性神經元具有良好保護作用，TrkB是NGF的高親和力受體，介導中樞神經元NGF依賴性細胞存活和分化[3-4]。筆者在本實驗中探討Pro對腦缺血-再灌注所致認知功能障礙的影響，及其對TrkB/Akt通路的作用，為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料成年雄性SD大鼠，購于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，體質量250～280 g。Pro標準品(德國費森尤斯公司惠贈，批號:J20040122)。DCS-2程控穿梭箱(中國醫(yī)學科學院藥物研究所產品)，MG-2Y型迷宮測試儀(江蘇省張家港市生物醫(yī)學儀器廠產品)。TrkB、p-Akt單克隆抗體購于Santa Cruz公司，其余試劑均為分析純。

1.2 腦缺血-再灌注模型的制備與分組將大鼠隨機分為4組，每組6只:假手術組(腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液)，缺血-再灌注組(模型組，腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液)，缺血-再灌注+Pro低、高劑量組(Pro分別為50和100 mg·kg－1，于缺血-再灌注開始前腹腔注射)。大鼠缺血-再灌注模型的制備采用改良的LONGA法[5]，以10%水合氯醛300 mg·kg－1腹腔注射麻醉，頸部正中切口，結扎左側頸外動脈遠端，熱凝其分支，頸總動脈及頸內動脈置動脈夾，斷開頸外動脈后插入遠端涂有硅膠、直徑0.24～0.26 mm的強力漁線，深度為距頸總動脈分叉處(18.0±0.5)mm，縫合皮膚。90 min后，拉漁線至頸外動脈殘端，血流再通。假手術組除插線外，其他步驟同模型組。

1.3 避暗實驗實驗第1天為訓練時間，將大鼠頭朝外放入避暗箱明室，大鼠會因趨暗的習性進入暗室，受到電擊1或2次而產生記憶。如大鼠不進入，則將其驅入暗室，使之產生記憶。第2天為測試時間，記錄大鼠從放入明室至首次進入暗室并遭電擊的時間，即進入暗室前的潛伏期和240 s內進入暗室的錯誤次數。

1.4 Y型迷宮實驗將受試大鼠放入Y型迷宮內適應環(huán)境3 min，然后給予電刺激，設定電擊電壓50 V，延遲時間5 s。隨機改變電擊區(qū)和安全區(qū)，大鼠遭遇電擊時直接逃避至安全區(qū)為正確反應，否則為錯誤反應。每電擊10次后休息5 min。學習成績以達到連續(xù)10次電擊中有9次正確反應(90%正確反應)前所受的累計電擊次數來表示。24 h后測定連續(xù)10次電擊中正確反應次數，作為記憶成績。

1.5 免疫組織化學再灌注后24 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸經左心室行主動脈插管，剪開右心房，以37℃0.9%氯化鈉溶液快速沖洗，再灌注預冷的4%多聚甲醛固定液。斷頭取腦后將組織固定于4%多聚甲醛固定液中6 h，再入25%蔗糖磷酸鹽緩沖液4℃過夜。待組織塊沉底后，恒冷箱冰凍切片機切片(厚20 μm)，用漂片法制作。生物素復合物(strejptavidin biotin complex，SABC)法檢測TrkB、p-Akt的表達。細胞質被染成棕黃色為陽性細胞。

1.6 Western Blot缺血-再灌注24 h后斷頭取腦，快速剝離缺血皮質，按照1∶9(W/V)加入裂解緩沖液，4℃勻漿，冰上放置1 h，4℃，12 000 r·min－1離心30 min。上清液進行蛋白定量，各組取總蛋白30 μg加入上樣緩沖液煮沸3 min變性，SDS-PAGE分離蛋白，電轉移至硝酸纖維素膜上。應用3%脫脂奶粉室溫封閉30 min，加入1∶1 000稀釋的TrkB、p-Akt 1抗4℃孵育過夜，與1∶10 000稀釋的2抗室溫孵育1 h，再與化學發(fā)光試劑溫育1 min后曝光、顯影和定影，測定吸光度。

1.7 統計學方法數據以均數±標準差(±s)表示，用SPSS12.0進行ANOVA檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 避暗實驗和Y型迷宮實驗結果與假手術組比較，模型組潛伏期明顯縮短，錯誤次數明顯增加;Pro各劑量組潛伏期較模型組明顯延長，錯誤次數減少。模型組出現明顯學習記憶功能障礙，與假手術組比較，累計電擊次數增加，正確反應次數減少。與模型組比較，Pro各劑量組累計電擊次數明顯減少，正確反應次數增加，差異有統計學意義，見表1。

2.2 TrkB表達及Akt活化免疫組織化學結果顯示，假手術組TrkB及p-Akt陽性細胞數較少;模型組缺血-再灌注后細胞數無明顯增多;Pro各劑量組細胞數顯著上調。Western Blot結果提示:與假手術組比較，模型組大鼠皮質TrkB及p-Akt表達無顯著變化，Pro各劑量組大鼠皮質TrkB及p-Akt表達顯著增高(n=6)，見圖1。

3 討論

Pro化學成分為2，6-二異丙基苯酚，與內源性抗氧化劑生育酚在結構上相似，該結構可與氧自由基反應并使之滅活，從而抑制氧自由基介導的脂質過氧化作用，降低自由基的產生，調節(jié)炎癥細胞趨化因子，減少炎癥細胞聚集，進而減輕炎癥細胞對機體的損傷，具有一定的抗腦缺血-再灌注損傷作用[6]。但其對缺血-再灌注所致認知功能障礙的影響筆者尚未見報道。

表1 4組大鼠避暗實驗和Y型迷宮實驗結果Tab.1Result of step-down test and Y-maze task test of 4 groups animals次，±s

表1 4組大鼠避暗實驗和Y型迷宮實驗結果Tab.1Result of step-down test and Y-maze task test of 4 groups animals次，±s

與模型組比較，*1P＜0.05，*2P＜0.01;與假手術組比較，*3P＜0.01Compared with model group，*1P＜0.05，*2P＜0.01;compared with sham operation group，*3P＜0.01

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圖1 4組大鼠皮質TrkB表達(A)及Akt活化(B)情況Fig.1TrkB expression(A)and Akt activation(B)in cortex of 4 groups of rats

腦缺血-再灌注后可導致缺血、低氧及周邊區(qū)域神經細胞的壞死和凋亡，其機制與誘導多種基因的表達，包括促凋亡基因和抑制凋亡基因有關。TrkB作為NGF的高親和力受體啟動了神經元分化及存活的信號級聯反應[7-8]，缺血-再灌注損傷4 h后，缺血側皮質就有TrkB表達升高，并且此升高一直持續(xù)到再灌注后第3天，TrkB的升高對缺血性腦損傷具有保護作用[9-10]。

筆者在本實驗中利用線栓法造成大腦中動脈栓塞的局灶性腦缺血-再灌注，制備大鼠學習記憶功能障礙模型。研究結果表明，Pro能延長避暗實驗中潛伏期，減少錯誤次數，減少Y型迷宮實驗中累計電擊次數，增加正確反應次數。提示Pro可改善腦缺血-再灌注損傷所致學習記憶障礙。本實驗中，假手術組TrkB及p-Akt陽性細胞數較少，模型組細胞數無明顯增多，而Pro各劑量組細胞數顯著上調。與假手術組比較，缺血-再灌注后大鼠皮質TrkB及p-Akt表達差異無統計學意義;而Pro各劑量組大鼠皮質TrkB及p-Akt表達則顯著增高。

綜上所述，Pro能明顯減輕腦缺血-再灌注所致認知功能障礙，可能通過調節(jié)缺血-再灌注損傷時保護性NGF的高親和力受體TrkB的表達和Akt活化，激活其下游信號分子，間接發(fā)揮其抗缺血性腦損傷的作用，但其對下游信號分子的具體作用機制尚需進一步研究。

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