張光明，郎 朗，李 鈺，馬 軍

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 市政環(huán)境工程學(xué)院，150090哈爾濱;2.中國(guó)人民大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，100872北京;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)研究中心，150028哈爾濱;4.哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，150001哈爾濱)

內(nèi)分泌干擾物(EDCs)可致人體內(nèi)分泌失調(diào)，引發(fā)多種疾病，還會(huì)對(duì)后代帶來(lái)不良影響.雙酚A是典型的雌激素類EDCs，可嚴(yán)重干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，威脅著胎兒和兒童的健康.歐盟認(rèn)為雙酚A會(huì)誘發(fā)性早熟，從2011年3月2日起，禁止生產(chǎn)含雙酚A的嬰兒奶瓶.在我國(guó)北京、上海、深圳、杭州等大中城市飲用水水源中均發(fā)現(xiàn)了一定濃度的雙酚A［1］，其雌激素活性的有效控制引起廣泛關(guān)注.雌二醇(E2)是人體天然雌激素的代表物質(zhì).前期研究發(fā)現(xiàn)E2與雙酚A共存時(shí)可以弱化雙酚A的雌激素活性［2］.這一現(xiàn)象對(duì)于控制雙酚A對(duì)人體尤其是女性的毒害作用具有重要意義.本文將深入研究這一現(xiàn)象發(fā)生的可能機(jī)制.

1 實(shí)驗(yàn)

所用乳腺癌MCF-7細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室自行培養(yǎng).雙酚A、E2、苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑肽酶A、亮抑肽酶、色胺酸等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司.丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)購(gòu)自美國(guó)Ameresco公司.其他材料為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?實(shí)驗(yàn)中雙酚A、E2濃度分別為10-8、10-12mol/L.所用主要設(shè)備包括GeneAmp?PCR System 9700(Applied Biosystems公司)、DYY-6B電泳儀(北京市六一儀器廠)、蛋白質(zhì)電泳及Western雜交轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad)、LSM Meta510激光共聚焦儀(Zeiss公司)、IGO 150二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司).

采用流式細(xì)胞儀法測(cè)定細(xì)胞周期的變化［3］.細(xì)胞增殖指數(shù)ⅠP=(nS+nG2)/(nG1+nS+nG2)×100%，nS為DNA合成期細(xì)胞數(shù);nG1為第1間隙期細(xì)胞數(shù);nG2為第2間隙期細(xì)胞數(shù).

采用WESTERN BLOT法測(cè)定乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α蛋白，以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白.該方法可檢測(cè)到低至10～100 pg的環(huán)境雌激素的干擾效應(yīng)［4］.蛋白樣品制備、SDS-PAGE電泳、Lowry法測(cè)定蛋白含量、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、顯影、定影等均參照分子生物學(xué)蛋白檢測(cè)方法［5］.以β-Tublin蛋白作為內(nèi)參照，對(duì)目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行校正.

采用RT-PCR法測(cè)定EDCs干擾效應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子C-fos、C-jun.步驟如下:細(xì)胞培養(yǎng)、RNA抽提、分離、沉淀、洗脫、再溶解、定量、逆轉(zhuǎn)錄(RT)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、電泳鑒定［5］.

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞分裂復(fù)制的過(guò)程稱為細(xì)胞周期.整個(gè)細(xì)胞周期被劃分為G1→S→G2→M→G1，其中最具特征性的階段是S期(DNA合成期)，經(jīng)過(guò)短暫間隙(G2)，進(jìn)入有絲分裂期(M期)，再經(jīng)過(guò)短暫間隙(G1)，開(kāi)始下一個(gè)周期.一旦調(diào)控系統(tǒng)發(fā)生故障，細(xì)胞就會(huì)過(guò)度增殖導(dǎo)致癌癥［6］.

從表1可以看出，E2、雙酚A及混合物均可改變MCF-7細(xì)胞周期，提高增殖指數(shù)ⅠP.E2使S期細(xì)胞比例由25.1%增加到34.2%，提高了9.1%，由于細(xì)胞在S期發(fā)生DNA合成，S期比例提高說(shuō)明DNA合成增加.雙酚A也可提高S期細(xì)胞比例，但效果較E2弱.而二者混合后，S期細(xì)胞提高比例進(jìn)一步降低.此外，雙酚A還可誘導(dǎo)G2期細(xì)胞比例增加5.4%，而E2則降低了G2期細(xì)胞比例1.3%.上述差異表明，E2與雙酚A對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖機(jī)制不同.

表1 E2與雙酚A聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞的周期變化%

2.2 蛋白表達(dá)

蛋白表達(dá)如圖1所示.顯然，空白組ERα蛋白表達(dá)良好，ERK系列蛋白表達(dá)較低，JNK系列蛋白與p38表達(dá)極弱，C-myc幾乎不表達(dá).各實(shí)驗(yàn)組的蛋白表達(dá)詳細(xì)分析見(jiàn)下文.

圖1 E2與雙酚A聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響

2.3 雌激素受體蛋白表達(dá)

EDCs干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的傳統(tǒng)途徑是與雌激素受體(ER)結(jié)合，從而使天然雌激素不能有效結(jié)合ER.在MCF-7細(xì)胞中最重要的ER是ERα蛋白［7］，因此，EDCs發(fā)揮雌激素活性主要是與ERα蛋白結(jié)合，使其不能正常表達(dá)，這是雌激素作用的經(jīng)典路徑［8］.圖2所示為E2、雙酚A、混合物對(duì)ERα蛋白的影響，E2對(duì)ERα蛋白的誘導(dǎo)能力最強(qiáng)、雙酚A最弱、混合物介于二者之間.圖2表明，E2、雙酚A、混合物均可通過(guò)經(jīng)典路徑——雌激素受體途徑發(fā)揮作用.

2.4MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究

除了經(jīng)典途徑外，EDCs起作用的另一個(gè)重要途徑是干擾MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.MAPKs(絲裂原活化蛋白激酶)是重要的信號(hào)傳遞者［9］，其種類眾多，最重要的有胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38等［10］.ERK1/2信號(hào)通路是經(jīng)典的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.活化的ERK1/2可磷酸化多種核轉(zhuǎn)錄因子，并誘導(dǎo)C-fos基因活化，增加C-fos蛋白合成［11］.

圖2 E2與雙酚A聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞ERα蛋白的影響

圖3所示為E2、雙酚A、混合物對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)ERK蛋白表達(dá)的影響.E2顯著提高了ERK蛋白的表達(dá)，雙酚A基本沒(méi)有影響，混合物效果略低于E2.圖4所示為三者對(duì)活化后的ERK——p-ERK蛋白的影響.溶劑對(duì)照組p-ERK蛋白不表達(dá)，E2顯著提高了p-ERK蛋白的表達(dá)量，而雙酚A基本沒(méi)有作用，混合物效果與E2相當(dāng)［12］.圖3、4均表明，雙酚A對(duì)ERK信號(hào)通路沒(méi)有作用.

圖3 E2與雙酚A聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞ERK蛋白的影響

圖4 E2與雙酚A聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞p-ERK蛋白的影響

圖5所示為E2、雙酚A、混合物對(duì)另一個(gè)重要MAPKs——JNK信號(hào)通路的影響.溶劑對(duì)照組JNK蛋白基本不表達(dá)，E2對(duì)其有一定增強(qiáng)作用，雙酚A使其大量表達(dá)，而混合物對(duì)JNK蛋白表達(dá)的促進(jìn)明顯高于E2或雙酚A.但由圖1可以看出，JNK蛋白的活化形式——p-JNK蛋白在各種條件下表達(dá)量都較低，表明E2及BPA雖然刺激了JNK蛋白表達(dá)，但最終不能提高其活性，JNK通路并非其作用途徑.

p38絲裂原活化蛋白激酶是MAPKs家族中的一員，調(diào)控應(yīng)激情況下的細(xì)胞增殖和凋亡［13］.如圖6所示，E2能夠誘導(dǎo)p38蛋白的表達(dá)，而BPA使p38蛋白的表達(dá)量下降，兩者混合后對(duì)p38的誘導(dǎo)介于兩者之間.由于p-p38蛋白不表達(dá)，判斷p38在E2、BPA及聯(lián)合誘導(dǎo)增殖中不發(fā)揮作用.C-myc通過(guò)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［14］.如圖7所示，溶劑組C-myc蛋白不表達(dá)，E2顯著誘導(dǎo)其表達(dá)，雙酚A對(duì)其沒(méi)有影響，而混合物的誘導(dǎo)效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于E2(0.092vs.0.017).如此顯著的降低表明，E2與雙酚A混合后，雌激素效應(yīng)降低的主要機(jī)制是C-myc蛋白表達(dá)受到了抑制.

圖5 E2與雙酚A聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞JNK蛋白的影響

圖6 E2與雙酚A聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞p38蛋白的影響

圖7 E2與雙酚A聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞C-myc蛋白的影響

如圖8所示，E2能夠誘導(dǎo)C-fos基因的表達(dá)，雙酚A對(duì)C-fos基因基本沒(méi)有影響，兩者聯(lián)合后作用介于兩者之間.如圖9所示，E2、雙酚A、混合物均可減弱C-jun基因的表達(dá)，混合物效應(yīng)略強(qiáng)，但差別不大.

圖8 E2與雙酚A聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞C-fos基因的誘導(dǎo)

圖9 E2與雙酚A聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞C-jun基因的影響

如圖10、11所示，E2、雙酚A、混合物均可誘導(dǎo)Ki67蛋白的表達(dá)且混合物表現(xiàn)出增強(qiáng)效應(yīng).E2顯著誘導(dǎo)cyclin D1蛋白表達(dá)，雙酚A較E2弱很多，聯(lián)合后E2使雙酚A對(duì)cyclin D1蛋白的誘導(dǎo)增強(qiáng).

圖10 E2與雙酚A聯(lián)合對(duì)Ki67蛋白的影響

圖11 E2與雙酚A聯(lián)合對(duì)cyclin D1蛋白的影響

3 結(jié)論

1)E2、雙酚A、混合物都具有雌激素效應(yīng)，可以促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖.E2既可以通過(guò)經(jīng)典途徑(雌激素受體)起作用，又可以通過(guò)非經(jīng)典途徑(ERK信號(hào)通路)起作用.

2)E2可以促進(jìn)C-myc基因與C-fos基因表達(dá)、誘導(dǎo)增殖蛋白Ki67與cyclin D1蛋白表達(dá)，增加DNA分裂期細(xì)胞比例，促進(jìn)細(xì)胞增殖.而雙酚A只通過(guò)雌激素受體途徑起作用，激活cyclin D1蛋白.兩者混合后，可通過(guò)受體途徑及ERK途徑發(fā)揮作用，促進(jìn)C-fos基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)Ki67蛋白表達(dá).然而，C-myc蛋白顯著下降，這可能是E2弱化雙酚A雌激素效應(yīng)的主要機(jī)制.

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