張 琦，高大文，陶 彧

(哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，150090哈爾濱)

目前，聚羥基烷酸酯(PHA)的微生物合成已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，且基本采用純菌發(fā)酵方式完成.但純菌發(fā)酵方式的生產(chǎn)成本高昂，產(chǎn)品在可生物降解的包裝材料、組織工程材料、緩釋材料等方面有廣闊的應用前景，只有進一步降低成本才可能被更廣泛應用［1］.活性污泥法是目前最有效的污水生物處理法之一，有研究證明在污水處理過程中存在PHA合成現(xiàn)象［2］.目前已有采用市政廢水［3］、糖蜜廢水［4-5］和制橄欖油廢水［6］等經(jīng)厭氧酸化處理后作為活性污泥的底物來合成PHA的報道，在廢水處理過程中合成PHA既能實現(xiàn)污水和污泥的資源化，還能降低PHA的生產(chǎn)成本.利用廢水培養(yǎng)活性污泥生產(chǎn)PHA的過程一般包括廢水厭氧處理、活性污泥馴化以及PHA合成3個階段［7-8］，如圖1所示.合成PHA活性污泥馴化培養(yǎng)的研究結(jié)果證明，外部營養(yǎng)物質(zhì)的供給在充足和缺乏狀態(tài)間動態(tài)變化，有利于活性污泥中合成PHA的微生物富集，還能夠促進合成能力的提高，這種培養(yǎng)方式被稱為豐盛-饑餓模式(或稱好氧動態(tài)補料工藝，ADF)［9］.多數(shù)研究中活性污泥的馴化培養(yǎng)和PHA的合成培養(yǎng)都采用ADF工藝，取得的最高PHA產(chǎn)量可達細胞干質(zhì)量的89%.目前的研究重點為PHA合成階段培養(yǎng)條件的優(yōu)化(DO、pH值、碳氮比、碳磷比等)［10-12］.研究表明，底物中氮和磷的質(zhì)量濃度過高或過低都不利于PHA合成，且其中氮源質(zhì)量濃度對其影響更為明顯［12］.在各研究中馴化階段所采用的底物組成和培養(yǎng)方式等一般與合成期保持一致，但未有結(jié)果表明與PHA合成階段相似的培養(yǎng)方式對活性污泥的馴化也最有效，而且關于馴化條件的優(yōu)化研究也鮮見報道.

圖1 階段合成工藝流程

為了提高活性污泥的馴化效果，增加PHA的產(chǎn)量，對比研究了單階段模式和雙階段模式下所馴化活性污泥的底物利用速率、污泥性質(zhì)和PHA產(chǎn)量，證明了雙階段模式更適于培養(yǎng)合成PHA的活性污泥.

1 試驗

1.1 活性污泥及培養(yǎng)設備

用于接種的活性污泥取自哈爾濱市某污水處理廠A/O工藝二沉池.污泥接種后，反應器內(nèi)污泥質(zhì)量濃度為800 mg/L左右，SVI為70 mL/g.

利用好氧序批式反應器(SBR)對活性污泥進行馴化培養(yǎng)，反應器的有效容積為1 L，每周期進水體積為0.5 L.采用ADF工藝進行培養(yǎng)，曝氣量為1 L/min，培養(yǎng)溫度為室溫(18～20℃).

1.2 人工廢水組成

本試驗中所利用的廢水全部為人工配水，其中模擬酸化廢水為馴化活性污泥的主要底物，由營養(yǎng)液和少量微量元素液組成，每升配水中加入2 mL的微量元素液，進水pH為6.6～6.7;模擬生活污水應用在雙階段馴化模式的過渡馴化期，COD為600 mg/L左右，BOD5為280 mg/L左右.兩種配水組成及質(zhì)量濃度如表1、2所示.

表1 模擬酸化廢水的組成 mg·L-1

表2 模擬生活污水組成 mg·L-1

1.3 試驗方法

單階段馴化模式:將取自污水處理廠二沉池的活性污泥混合液接種到SBR反應器中，利用模擬酸化廢水進行馴化培養(yǎng)，SBR周期為12 h(包括曝氣660 min，靜沉40 min，進水、排水各10 min)，每日排出100 mL污泥混合液，污泥齡(SRT)為10 d(見表3).

雙階段馴化模式:培養(yǎng)過程分為過渡馴化和繼續(xù)馴化兩個時期.過渡馴化期:SBR周期為8 h(包括曝氣420 min，靜沉40 min，進水、排水各10 min)，每天運行3個周期，不排泥.活性污泥接種后先利用模擬生活污水進行培養(yǎng)，運行1 d后，進水中模擬生活污水量每日減半，不足部分用模擬酸化廢水補充.運行到第3天時進水中的模擬生活污水僅占1/8，到第4天開始完全用模擬酸化廢水進行培養(yǎng)，再繼續(xù)運行2 d，完成過渡馴化.繼續(xù)馴化期:延長SBR周期到12 h(包括曝氣660 min，靜沉40 min，進水、排水各10 min)，每晝夜運行兩個周期，每日排出100 mL污泥混合液，控制污泥齡為10 d，繼續(xù)馴化至污泥質(zhì)量濃度以及活性污泥對各物質(zhì)的代謝(碳源、PHA)都達到穩(wěn)定狀態(tài)(見表3).

表3 運行參數(shù)對比

1.4 檢測方法

從反應器中取4 mL樣品，離心后使固液分離，上層清液用于乙酸質(zhì)量濃度檢測，下層固體為活性污泥，用于PHA含量檢測.

PHA質(zhì)量分數(shù)檢測［12］:將樣品至于-20℃冰箱中，完全冷凍后放置于真空冷凍干燥機中凍干;凍干后的樣品經(jīng)稱重后加入2 mL氯仿和2 mL苯甲酸、甲醇和硫酸混合溶液中，105℃消解;再加入超純水，經(jīng)充分振蕩后低溫靜置使液體分層，吸取下層有機相，利用氣相色譜和FID檢測器測定含量.

乙酸質(zhì)量濃度檢測:先將樣品透過0.45 μm的濾膜，去除樣品中的微生物等雜質(zhì);再加入甲酸酸化，以環(huán)己酮和乙酸丁酯為內(nèi)標物，利用氣象色譜和FID檢測器檢測質(zhì)量濃度.

試驗中測定的其他指標主要有NH4-N、溶解性正磷酸鹽(SOP)、MLSS、MLVSS，檢測方法采用國家環(huán)?？偩诸C布的標準方法［13］.

2 結(jié)果與分析

2.1 底物代謝

利用單階段馴化模式進行培養(yǎng)的反應器內(nèi)乙酸、氨氮和正磷酸鹽的質(zhì)量濃度都在進水后90 min內(nèi)顯著降低，其中乙酸和氨氮被完全利用;磷酸鹽相對過量，90 min后質(zhì)量濃度保持在30 mg/L左右.在底物快速消耗階段，其利用速率分別為乙酸8.8mg/(L·min)，氨氮0.3 mg/(L·min)，正磷酸鹽0.3 mg/(L·min).底物中各物質(zhì)質(zhì)量濃度隨時間變化見圖2所示.

圖2 單階段培養(yǎng)體系中營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量濃度變化

以雙階段馴化模式運行的反應器內(nèi)活性污泥對底物的利用情況有所不同.乙酸在進水的前30 min內(nèi)被快速利用，之后其質(zhì)量濃度保持在較低水平，利用速率為27.3 mg/(L·min);進水氨氮質(zhì)量濃度為46 mg/L，前120 min內(nèi)氨氮質(zhì)量濃度快速下降，之后降速變緩，到周期結(jié)束時出水氨氮質(zhì)量濃度為14.2 mg/L，快速消耗期的吸收速率為0.2 mg/(L·min);磷酸鹽在進水后120 min內(nèi)被全部利用，吸收速率為0.3 mg/(L·min).底物中各物質(zhì)質(zhì)量濃度隨時間變化如圖3所示.

圖3 雙階段培養(yǎng)體系中營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量濃度變化

純菌種合成PHA是通過脂肪酸β-氧化及從頭合成等途徑完成的［1］，需多種PHA合成酶和輔酶等蛋白質(zhì)類物質(zhì)參與［14］.目前尚沒有能夠直接解釋混合菌種吸收底物合成PHA機理的研究，但混合菌種吸收底物合成PHA的過程和純菌種有一定的相似性，即活性污泥中微生物需從底物中吸收氮源用于合成相關酶等功能物質(zhì).Takabatake等［15］在研究含氮化合物對于活性污泥合成PHA的影響時發(fā)現(xiàn):底物中加入含氮化合物能夠促進微生物細胞中蛋白質(zhì)和碳水化合物含量提高，且加入含氮化合物的體系內(nèi)碳源利用速率也較不加氮源的體系有明顯提高.本研究中，雙階段馴化模式下進水氨氮質(zhì)量濃度高于單階段馴化模式，氨氮質(zhì)量濃度相對過量，能夠充足供給微生物合成功能性物質(zhì)所需的氮元素，使微生物細胞中相關酶和輔酶量增加，增強微生物利用底物合成PHA能力，因此底物中碳源能夠在短時間內(nèi)被快速利用，乙酸的利用速率從8.8 mg/(L·min)加快到27.3 mg/(L·min)，提高了210%.雙階段模式中過渡期的培養(yǎng)過程也能夠在一定程度上增強活性污泥中微生物的活性，但活性污泥對底物的利用效果考查主要是在馴化培養(yǎng)達到穩(wěn)定后(培養(yǎng)第15天后)進行的，所以相對而言，過渡期培養(yǎng)的影響相對較小.

2.2 污泥性質(zhì)

單階段馴化模式培養(yǎng)試驗中，從污泥接種到運行第10天期間未對反應器排泥.第10天MLVSS為3 000 mg/L，之后每周期排出50 mL泥水混合物，保持SRT為10 d，MLVSS開始下降，5 d后穩(wěn)定在2 000 mg/L左右，SVI在80 mg/L左右.運行到第20天，活性污泥沉降性能快速惡化，SVI上升至300～600 mL/g，MLVSS快速下降到1 200 mg/L.結(jié)合以往研究結(jié)果［16］，分析其原因可能是在氮源相對不足的狀態(tài)下，絲狀菌較大的比表面積可以最大限度地吸收營養(yǎng)元素，與其他微生物競爭時能很快占據(jù)優(yōu)勢地位，導致污泥的SVI急劇升高，系統(tǒng)崩潰.

雙階段馴化模式培養(yǎng)的活性污泥在增殖速率和MLVSS等方面有顯著改善.過渡馴化期一般在5～6 d內(nèi)基本結(jié)束，由于在此期間反應器不排泥，活性污泥質(zhì)量濃度快速增加，過渡馴化完成時活性污泥質(zhì)量濃度為3 000 mg/L.之后開始繼續(xù)馴化階段，每周期排出50 mL污泥，保持SRT為10 d，MLVSS仍繼續(xù)增加，反應器運行到第15天MLVSS可達4 500 mg/L左右，比單階段模式增加了125%.馴化培養(yǎng)到第35天，活性污泥沉降性能仍然較好，SVI為80 mL/g左右.

前人研究表明，混合菌種中微生物吸收底物主要用于合成儲藏性物質(zhì)和細胞增殖，與活性污泥中其他微生物相比，合成PHA的微生物將吸收的底物更多地用于PHA合成而非細胞增殖［9］，因此，活性污泥中合成PHA的微生物的增殖性能相對較弱.雙階段馴化模式在馴化初期不排泥有利于提高污泥質(zhì)量濃度，即有利于富集合成PHA的微生物.試驗采用的活性污泥取自于污水處理廠，在過渡馴化期進水從類似于生活污水的模擬生活污水逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槟M酸化廢水，有助于微生物適應馴化環(huán)境，保持較高的增殖量和較高的PHA合成活性.反應器運行到第5天時，單階段馴化模式下MLVSS為1 700 mg/L，而雙階段馴化模式下MLVSS提高了1.8倍，達3 000 mg/L.活性污泥在短時間內(nèi)達到較高質(zhì)量濃度，有利于縮短馴化時間，提高馴化效率.由于雙階段馴化模式下充分供給氨氮，微生物增殖不受氨氮質(zhì)量濃度限制，因此，微生物的增殖能力比單階段模式有所增強，反應器開始定期排泥后MLVSS仍不斷增加，提高了馴化產(chǎn)出的活性污泥量，從而最終提高PHA的產(chǎn)量.有研究表明活性污泥的沉降性能不影響PHA在細胞中的含量［17］，但是污泥膨脹導致污泥質(zhì)量濃度迅速降低，引起PHA產(chǎn)量降低，甚至體系崩潰，同時，污泥的沉降性能下降也會引起污水處理過程中的出水水質(zhì)降低，因此，雙階段馴化模式在維持活性污泥良好性能方面也更有優(yōu)勢.

2.3 PHA合成能力

與單階段模式相比，雙階段模式培養(yǎng)的活性污泥合成PHA的能力更強(見圖4).在單階段模式下，活性污泥中PHA的質(zhì)量分數(shù)在90 min時達到最高，占污泥干質(zhì)量的7.8%，單位乙酸合成量為0.19 g/g.雙階段馴化模式下，PHA質(zhì)量分數(shù)提前60 min達到最大值，合成速率明顯加快，且質(zhì)量分數(shù)可達污泥干質(zhì)量的8.5%，單位乙酸PHA合成量為0.24 g/g，比單階段模式下的合成量有所提高，因此認為雙階段模式馴化的活性污泥合成PHA的速率更快，PHA合成能力更強.原因是雙階段模式中的過渡馴化期促進了活性污泥中合成PHA微生物的富集，逐漸變化的進水策略也使微生物逐漸適應馴化環(huán)境，避免了環(huán)境突然改變引起的激性反應，使微生物保持較高生命活性，PHA合成能力也相應地得到提高.李偉等［18］在考察碳源質(zhì)量濃度對聚羥基丁酸(PHB)產(chǎn)量的影響研究中發(fā)現(xiàn):當反應器中乙酸質(zhì)量濃度為1 479 mg/L時，單位乙酸合成量僅為0.2 g/g;而在乙酸質(zhì)量濃度為2 925 mg/L時，單位乙酸PHB的合成量為0.4 g/g，PHB最高質(zhì)量分數(shù)占細胞干質(zhì)量的56.3%，且在乙酸質(zhì)量濃度小于2 925 mg/L時，PHB合成量隨乙酸質(zhì)量濃度增加而增加.本研究的雙階段模式馴化結(jié)果表明:在碳源質(zhì)量濃度比文獻報道低的情況下，活性污泥吸收碳源用于合成PHA的量更高，這說明雙階段模式馴化的活性污泥合成PHA的能力更強.若在合成期配合采取適當?shù)氖侄?如提高碳源質(zhì)量濃度、改變碳源投加方式等)促進微生物細胞中PHA的積累，污泥中的PHA質(zhì)量分數(shù)可能達到更高水平，但是其效果有待進一步研究.

圖4 不同馴化模式培養(yǎng)下PHA質(zhì)量分數(shù)的變化

以往多數(shù)研究表明，在氮、磷質(zhì)量濃度較低等生長受限環(huán)境下，微生物會將吸收的大部分底物用于合成PHA，即氮、磷質(zhì)量濃度較低的底物能促進微生物合成PHA能力的提高［19］，因此，在利用實際廢水進行PHA生產(chǎn)過程之前需對廢水進行脫氮除磷處理.但也有研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)底物中是否加入含氮化合物對活性污泥中PHA的質(zhì)量分數(shù)影響不大［15］.本試驗中，體系中氨氮質(zhì)量濃度從30 mg/L提高到46 mg/L后，PHA占污泥干質(zhì)量的量略有提高(從7.8%提高到8.5%)，且其合成量沒有受到抑制，反而有所增加(提高4倍)，因此，在馴化培養(yǎng)過程中供給相對充足的氮源對于提高活性污泥合成PHA的能力具有重要作用.說明在馴化合成PHA的活性污泥時，可以利用不經(jīng)脫氮除磷處理的實際廢水，從而更大程度降低PHA生產(chǎn)成本.

3 結(jié)論

1)雙階段馴化模式下乙酸利用速率比單階段馴化模式下提高210%;PHA含量比單階段提前60 min達到最大值，且PHA合成量比單階段馴化模式更高.雙階段馴化模式培養(yǎng)的活性污泥吸收碳源合成PHA的能力更強.

2)雙階段模式培養(yǎng)下活性污泥中微生物增殖更快，體系內(nèi)污泥質(zhì)量濃度比單階段模式培養(yǎng)的體系內(nèi)增加125%.雙階馴化模式中增加的過渡馴化期有利于活性污泥中微生物對馴化環(huán)境的逐步適應，及合成PHA微生物的富集.

3)馴化階段氮源的充足供給有利于促進微生物增殖、碳源吸收以及PHA合成能力的提高，因此，含氮、磷的廢水無需脫氮除磷處理可直接用于PHA的馴化培養(yǎng)，從而降低生產(chǎn)成本.

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