衛(wèi)文俊，陶霖玉，李蓉，陳玲，王玉蓉，曾鳳好

(廣東醫(yī)學院附屬深圳南山醫(yī)院普外科，廣東深圳 518052)

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)是一類起病急、病情復雜、治療棘手的臨床常見急腹癥，其病情的演變及加重與繼發(fā)的局部和全身炎癥介質的過度釋放、全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory syndrome，SRIS)有關。烏司他丁(ulinastatin)是從人尿液中分離、純化的尿胰蛋白酶抑制劑。動物實驗表明，烏司他丁對急性胰腺炎具有明顯的抗炎治療效果;部分臨床研究也提示其具有控制病情、緩解癥狀的作用。但關于其作用機制仍未完全明了，并存在爭議［1-2］。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)屬于一種病原微生物模式識別受體，作為脂多糖的跨膜受體，是炎癥反應的門戶蛋白，在免疫防御反應中起著十分重要的作用［3］。烏司他丁對急性胰腺炎引起的全身炎癥反應的拮抗及抑制作用是否與抑制單核細胞表面Toll樣受體4的表達有關，目前尚不明確。本研究旨在觀察烏司他丁對重癥急性胰腺炎患者外周血單核細胞Toll樣受體4表達的影響，探討烏司他丁治療重癥急性胰腺炎的作用靶點及抑制炎癥反應的作用機制。

1 資料和方法

1.1 研究對象

根據中華醫(yī)學會外科學會急性胰腺炎的臨床診斷及分級標準(1996年第2次方案)，選擇2008年6月至2011年6月在我院住院的重癥急性胰腺炎患者58例，其中男31例，女27例，年齡28～62歲，平均(38±6)歲，隨機分為烏司他丁組(29例，予以常規(guī)治療+烏司他丁)、常規(guī)組(29例，予以常規(guī)治療)。另外，選擇20例健康志愿者作為對照組，其中男11例，女9例，年齡26～60歲，平均(35±5)歲。3組間性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

1.2 主要試劑和儀器

流式細胞儀CYTOMICS FC 500購自Beckman公司，藻紅蛋白(PE)標記的抗人TLR4單克隆抗體購自eBioscience公司(美國)，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗人CD14單克隆抗體購自Beckman Coulter公司，TNF-α、IL-6 檢測試劑盒(Quantikine EL ISA Kit，R ＆D Systems)購自Minneapolis公司。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 (1)常規(guī)組:予以禁食、胃腸減壓、抑制胰酶活性、糾正水電解質平衡、搶救休克、預防感染及營養(yǎng)支持等治療。(2)烏司他丁組:在常規(guī)治療的基礎上，予烏司他丁10萬U溶于5%葡萄糖注射液500 ml，靜脈滴注，每天2次，每次2 h滴完，3 d后改為10萬U，每天1次，療程7～14 d。

1.3.2 標本的采集和處理 用無熱源的EDTA K2抗凝的無菌真空采集管采集SAP患者入院第1天治療前，入院后第3、5、7、14天的靜脈血各 15 ml。對照組僅采血1次。血標本均在30 min內處理:4℃離心5 min后，提取0.5 ml血漿，置冰箱－70℃凍存用于檢測細胞因子。

1.3.3 TLR4、CD14檢測 血標本于12 h內進行直接免疫熒光標記單核細胞表面CD 14和TLR 4，以流式細胞儀檢測CD 14和TLR 4表達。方法為100 μl全血 +5 μl TLR4-PE+10 μl CD14-FITC，避 光 孵 育20 min，加入 Optilyse C溶血素(Beckman Coulter公司)500 μl，溶血 10 min，1 500 × g 離心 5 min，加入2 ml PBS混勻，1 500 ×g離心 5 min，加入 500 μl PBS后上機檢測，以CD14圈門，檢測門內細胞PE的平均熒光強度，用Mouse IgG2a作為同型對照。

1.3.4 血漿 TNF-α、IL-6的檢測 以 ELISA試劑盒檢測血漿TNF-α、IL-6水平，操作嚴格按試劑盒說明進行。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 3 組 TLR4、CD14 的表達

見表1。

表1 3組外周血單核細胞表面TLR4的表達變化(±s)Tab 1 The expression of TLR4 on PBMCs among the three groups( ±s)

表1 3組外周血單核細胞表面TLR4的表達變化(±s)Tab 1 The expression of TLR4 on PBMCs among the three groups( ±s)

與對照組比較，a P ＜0.01，b P ＜0.05;與常規(guī)組比較，c P ＜0.05

組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 5.01 ±1.21 － － － －常規(guī)組 29 11.86 ±2.59a 10.25 ±2.24b 8.65 ±2.89b 6.28 ±2.32b 5.10 ±2.74烏司他丁組 29 12.20 ±2.26a 8.02 ±2.45bc 6.21 ±3.21bc 5.05 ±2.36c 4.95 ±2.33

由表1可見，與對照組比較，在入院第1天常規(guī)組和烏司他丁組患者外周血單核細胞TLR4表達明顯增高(均P＜0.01)，在入院治療后第3、5天 TLR4表達逐漸降低，但仍高于對照組(均P＜0.05)。烏司他丁組在入院后第7天TLR4表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，入院后第14天兩組TLR4表達均基本恢復正常。烏司他丁組與常規(guī)組在入院第1天治療前，外周血單核細胞TLR4表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而在治療后第 3、5、7 天烏司他丁組外周血單核細胞TLR4的表達均明顯低于常規(guī)組(P＜0.05)。CD14的表達在3組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，見表2)。

表2 各組外周血單核細胞CD14的表達變化(±s)Tab 2 The expression of CD14 on PBMCs among the three groups( ±s)

表2 各組外周血單核細胞CD14的表達變化(±s)Tab 2 The expression of CD14 on PBMCs among the three groups( ±s)

組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 17.35 ±4.21 － － － －常規(guī)組 29 17.88 ±4.86 17.52 ±3.96 17.42 ±3.94 16.98 ±4.28 17.11 ±4.08烏司他丁組 29 17.69 ±5.20 17.54 ±5.36 17.29 ±4.57 17.19 ±4.12 17.23 ±5.14

2.2 3 組 TNF-α、IL-6 濃度的檢測

常規(guī)組和烏司他丁組入院第1天外周血TNF-α、IL-6的濃度均明顯高于對照組(P＜0.01)，入院治療后第3、5、7天逐漸降低，但仍較對照組增高(P＜0.05);烏司他丁組在治療后第3、5、7天，外周血TNF-α、IL-6的濃度與常規(guī)組對應時點比較均明顯降低(P＜0.05，見表3、4)。

表3 各組血漿中TNF-α濃度水平(±s)Tab 3 Blood concentration of TNF-α among the three groups( ± s) pg·ml－1

表3 各組血漿中TNF-α濃度水平(±s)Tab 3 Blood concentration of TNF-α among the three groups( ± s) pg·ml－1

與對照組比較，a P ＜0.01，b P ＜0.05;與常規(guī)組比較，c P ＜0.05

組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 12.52 ±2.03 － － － －常規(guī)組 29 32.65 ±5.26a 29.87 ±4.96b 24.64 ±5.94b 20.57 ±4.38b 13.36 ±4.26烏司他丁組 29 33.15 ±6.12a 24.25 ±5.18bc 19.75 ±4.65bc 14.69 ±4.85bc 12.23 ±5.24

表4 各組血漿中IL-6濃度水平(±s)Tab 4 Blood concentration of IL-6 among the three groups( ± s) pg·ml－1

表4 各組血漿中IL-6濃度水平(±s)Tab 4 Blood concentration of IL-6 among the three groups( ± s) pg·ml－1

與對照組比較，a P ＜0.01，b P ＜0.05;與常規(guī)組比較，c P ＜0.05

組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 17.58 ±4.65 － － － －常規(guī)組 29 32.65 ±5.01a 28.77 ±4.85b 26.64 ±5.88b 21.57 ±4.12b 17.36 ±4.09烏司他丁組 29 31.21 ±6.25a 25.65 ±5.84bc 21.75 ±4.45bc 18.69 ±4.61bc 16.89 ±5.61

2.3 SAP外周血單核細胞 TLR4的表達與血漿TNF-α、IL-6 濃度的相關性

Pearson相關分析表明，常規(guī)組與烏司他丁組組內對應各時間點，SAP患者外周血單核細胞TLR4表達水平與血漿TNF-α的濃度變化一致，二者具有正相關性(r=0.953，P＜0.05);血漿 IL-6 濃度的變化在各組內對應時間點與TLR4表達的變化亦具有正相關性(r=0.902，P＜0.5)。

3 討 論

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是近年來被認識的病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)的受體，且被認為是炎癥瀑鏈式反應的閘門。TLRs屬于Ⅰ類跨膜受體，其胞外結構域負責刺激信號識別，而胞內則是稱為Toll/IL-1R(TIR)的結構域，與信號的傳導相關。TLRs廣泛分布于單核巨噬細胞系統(tǒng)、內皮細胞和樹突細胞等［4］，其配體包括脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)和脂蛋白等。現已在人體和小鼠體內發(fā)現13種TLR，分別命名為 TLR1～TLR13。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是第一個被發(fā)現的Toll樣受體，作為脂多糖(LPS)受體，介導LPS或內毒素引起的胞內信號傳遞，其激活將引起一系列下游分子的活化，最后激活通用轉錄因子NF-κB，最終引起以TNF-a等為中心的前炎癥因子激活，導致多種炎癥因子的瀑鏈式釋放而產生生物學效應［5］，因此，它可能作為急性炎癥反應損傷的扳機點啟動機體的這種病理過程。有研究［6］表明，TLR4在急性胰腺炎觸發(fā)急性炎癥反應的過程中具有重要作用，并與多器官功能障礙和腸源性感染的發(fā)生密切相關。因此，以TLR4為靶點控制這種瀑鏈式炎癥反應的有序性，可能是解決類似臨床問題的新方向［7］。

烏司他丁(ulinastatin)為一種糖蛋白，含有143個氨基酸，分子量約67 kD，是一種典型的Kuniz型的蛋白酶抑制劑，具有兩個活性功能區(qū)，兩個活性功能區(qū)均有很廣的抑酶譜，能夠同時抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明質酸酶、彈性蛋白酶等多種水解酶的活性，同時烏司他丁不但對中性粒細胞蛋白酶具有較強的抑制作用，而且還能抑制白細胞釋放炎性介質，其機制可能是通過阻斷蛋白酶所介導的中性細胞聚集，從而減輕了炎性介質與氧自由基的釋放，有效制約了酶、細胞因子、氧自由基級聯反應所形成的炎癥放大效應［8］。烏司他丁用于重癥急性胰腺炎的治療，可改善臨床癥狀、提高治療效果，但其作用是否與抑制TLR4有關尚不明了。

本研究結果顯示，與對照組相比較，重癥急性胰腺炎早期，外周血單核細胞TLR4表達明顯增高，隨后逐漸下降，至7 d左右恢復正常;血中TNF-α、IL-6濃度與TLR4變化一致。表明SAP早期可能通過先天性免疫門戶蛋白TLR4激活單核巨噬細胞系統(tǒng)NF-κB等下游信號因子，導致TNF-α等促炎細胞因子的產生和釋放。烏司他丁組在常規(guī)治療的基礎上，在發(fā)病早期即應用烏司他丁治療，結果在治療后第3天始，外周血單核細胞TLR4的表達均比相應常規(guī)組明顯降低，在各對應時點TNF-α、IL-6濃度下降的更快，并且恢復時間也明顯縮短，由此推測，烏司他丁可能對外周血單核細胞表面TLR4的表達有抑制作用，其對重癥急性胰腺炎引起的全身炎癥反應的拮抗作用可能與其對TLR4表達的抑制進而減少TNF-α、IL-6等炎癥因子有關。

綜上所述，重癥急性胰腺炎早期引起的全身炎癥反應與外周血單核細胞表面TLR4的表達異常有關，烏司他丁可能通過影響TLR4的表達起到抑制炎癥反應進而改善預后的作用，但其與TLR4具體的作用機制和相互關系仍需進一步研究。

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