歐陽資章 龍啟才

[摘要] 目的 研究紅毛五加提取物的抗腫瘤活性。 方法 分別采用MTT法、形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)方法檢測純氯仿洗脫部分對腫瘤細(xì)胞OVCAR3的生長抑制及促凋亡。 結(jié)果 MTT法可見氯仿洗脫部分對體外培養(yǎng)的卵巢上皮癌細(xì)胞OVCAR3的生長有抑制作用，高、低劑量組抑制率分別為20.6%、11.4%；形態(tài)學(xué)以及流式細(xì)胞術(shù)都可見氯仿洗脫部分可以促進(jìn)OVCAR3凋亡。 結(jié)論 紅毛五加純氯仿洗脫部分對腫瘤細(xì)胞株OVCAR3細(xì)胞有促凋亡的作用。

[關(guān)鍵詞] 紅毛五加；凋亡；OVCAR3；卵巢癌

[中圖分類號] R-33[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1674-4721（2012）07（c）-0010-03

Apoptosis of ovarian cancer cell lines OVCAR-3 induced by the extract Acanthopanax giraldii Harms

OUYANG Zizhang1 LONG Qicai2

1. The People′s Hospital of Qingyuan City in Guangdong Province, Qingyuan 511518, China; 2. College of Pharmacy, Sun Yat-sun University, Guangdong Province, Guangzhou 510006, China

[Abstract] Objective To investigate the anti-tumor activity of extract from Acanthopanax giraldii Harms. Methods Growth inhibition and promote apoptosis of cancer cell lines OVCAR3 by the chloroform eluting parts were measured by MTT method, morphological method and flow cytometry methods respectively. Results The chloroform eluting parts had the inhibitory action on the growth of ovarian cancer cell lines OVCAR-3 cultured in vitro. Inhibitory ratios of high and low dose group were 20.6% and 11.4% respectively. The chloroform eluting parts could inhance the apoptosis of OVCAR3 in morphological method and flow cytometry methods. Conclusion The chloroform eluting parts from Acanthopanax giraldii Harms has the effect to promote the apoptosis of cancer cell lines OVCAR3.

[Key words] Acanthopanax giraldii Harms; Apoptosis; OVCAR3; Ovarian cancer

紅毛五加為五加科植物，以莖皮入藥，性溫、味辛、入肝腎經(jīng)。具有祛風(fēng)除濕，通關(guān)節(jié)、強(qiáng)筋骨之功效，主治風(fēng)寒濕痹、足膝無力等癥[1]，現(xiàn)代藥理試驗(yàn)證明紅毛五加多糖對體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞抑制作用[2]，能通過抑制原癌基因，激活抑癌基因和細(xì)胞因子，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[3]，在抗腫瘤的同時(shí)對健康人細(xì)胞無影響[4]。紅毛五加莖皮揮發(fā)油成分對體外培養(yǎng)人白血病粒細(xì)胞有明顯抑制癌細(xì)胞生長效應(yīng)，抑制率達(dá)90%[5]。COX-2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，COX-2 通過旁分泌和自分泌直接地或通過上調(diào)芳香族酶的活性間接地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[6-8]。在前期的實(shí)驗(yàn)中，筆者提取分離的紅毛五加正丁醇萃取部分經(jīng)氯仿洗脫部分能通過抑制COX-2，從而抑制炎癥因子PGE2產(chǎn)生，具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。在此文中，筆者以人卵巢上皮癌細(xì)胞 OVCAR3為模型細(xì)胞研究此部分提取分離物是否也具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紅毛五加由中山大學(xué)藥學(xué)院楊得坡教授鑒定為紅毛五加（Acanthopanax giraldii Harms.）的莖皮；紅毛五加提取物為紅毛五加正丁醇萃取部分經(jīng)氯仿洗脫部分；人卵巢上皮癌細(xì)胞OVCAR3（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心細(xì)胞庫）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：1380549）；胎牛血清（杭州四季青公司，批號：080919）；Hoechst33258（美國Sigma公司，批號為：CE294011）；碘化嘧啶PI（美國Sigma公司，批號：247208120）；MTT（碧云天生物技術(shù)研究所，批號：080721）；塞來昔布（美國輝瑞公司，批號：639T）；實(shí)驗(yàn)中所用甲醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、乙醇等試劑均為分析純；CO2培養(yǎng)箱（德國 HERAEUS公司）；超凈工作臺（HEAL FORCE公司）；DMI4000B倒置顯微鏡（德國Leica公司）；Thermo 多功能酶標(biāo)儀（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；流式細(xì)胞儀（美國 BD FACS Calibur）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MTT法檢測純氯仿洗脫組分對OVCAR3細(xì)胞生長抑制作用取對數(shù)生長期OVCAR3細(xì)胞，以每孔10³個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為200 μL，將培養(yǎng)板放入CO₂孵箱，在37℃，5%CO2以及飽和條件下，培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入180 μL培養(yǎng)基，隨即按照試驗(yàn)分組加入20μL試驗(yàn)藥物，對照組加入20 μL培養(yǎng)基，使藥物達(dá)到相應(yīng)的藥物濃度，孵育48 h，每孔加入MTT溶液（5 mg/L）20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，PBS洗滌3次，每孔加入150 mL DMSO，振蕩10 min，使甲臜充分溶解，選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

1.2.2 形態(tài)學(xué)檢測純氯仿洗脫部分對OVCAR3細(xì)胞促凋亡作用取潔凈的蓋玻片于70%乙醇浸泡5 min，無菌超凈臺內(nèi)吹干，將蓋玻片置于6孔板內(nèi)，接種細(xì)胞10^-6，培養(yǎng)過夜，吸棄培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)基0.9 mL，加入藥物0.1 mL，使藥物達(dá)到試驗(yàn)濃度，正常對照組加入培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸棄培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液，固定15 min，去固定液，用PBS洗滌2次，每次3 min，吸盡液體，加入0.5 mL Hoechst33258染色液，染色5 min，熒光顯微鏡照相。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測純氯仿洗脫部分對OVCAR3細(xì)胞周期阻滯作用取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，以每孔10⁶個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔體積為1 mL，培養(yǎng)過夜，吸棄培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)基0.9 mL，同時(shí)加入藥物0.1 mL，使藥物達(dá)到試驗(yàn)濃度，正常對照組加入培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整待測細(xì)胞的密度為1×106個(gè)/mL，取1 mL細(xì)胞，1 000轉(zhuǎn)/min，4℃離心10 min，棄除上清液，加入1 mL冷的PBS，輕輕振搖使細(xì)胞懸浮，1 000 rpm 4℃離心10 min棄去上清液，重復(fù)步驟3，4兩次，將細(xì)胞重懸浮于200 μL結(jié)合緩沖液，加入5 μL的PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μL結(jié)合緩沖液，立即用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，抑制率以百分率表示，采用SPSS 17.0 for Windows軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行兩獨(dú)立樣本資料t檢驗(yàn)（抑制率以卡方檢驗(yàn)），P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 純氯仿洗脫部分對癌細(xì)胞生長的抑制作用

正常對照組細(xì)胞24 h培養(yǎng)后的OD值為0.543±0.013，塞來昔布作用后的OD值為0.504±0.018，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），氯仿洗脫部分40 mg/L作用后的OD值為0.511±0.010，10 mg/L作用后的OD值為0.528±0.010，氯仿洗脫部分兩個(gè)劑量組的OD值與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），高、低劑量組的抑制率分別為20.6%、11.4%，見表1。

2.2 形態(tài)學(xué)結(jié)果

正常細(xì)胞多角型，核為橢圓型，核大，核質(zhì)均勻；細(xì)胞核濃縮，核形狀有長棒狀、環(huán)形、不規(guī)則形，且熒光增強(qiáng)為凋亡細(xì)胞。如圖1所示，正常對照組未見凋亡細(xì)胞，而塞來昔布組可見典型的凋亡細(xì)胞，且凋亡細(xì)胞數(shù)量較多。試驗(yàn)藥物的高，低劑量組同樣可見典型的凋亡細(xì)胞。

2.3 流式結(jié)果

見圖2。如圖2所示，純氯仿洗脫部分高、低、以及陽性藥物劑量組都可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為26.0%、15.0%、32.7%，與形態(tài)學(xué)結(jié)果基本一致。

3 討論

紅毛五加為五加科植物，來源廣泛，具有多種作用，如抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體免疫力等作用，以前的研究表明紅毛五加多糖具有抗腫瘤作用，但未見紅毛五加其他成分是否具有抗腫瘤作用研究。在前期的研究中，筆者對紅毛五加抗炎成分進(jìn)行了初步篩選，并研究了其抗炎的作用機(jī)制與抑制COX-2有關(guān)。COX-2高表達(dá)與腫瘤有關(guān)，卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率居女性生殖器官惡性腫瘤的前幾位。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2 在卵巢腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常的卵巢上皮中不表達(dá)[9-11]，COX-2 的表達(dá)與卵巢癌的級別呈正相關(guān)[12]。既然COX-2與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)COX-2 來防治腫瘤已成為當(dāng)今腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。NSAIDs有可能通過抑制COX-2合成而抑制腫瘤血管生成起到抑制腫瘤的效果[13-15]。既然紅毛五加中的乙醇提取物中純氯仿洗脫液中含有抑制COX-2活性的成分，所以筆者設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)探討純氯仿洗脫部分是否對卵巢腫瘤細(xì)胞的生長有抑制作用。筆者采用體外實(shí)驗(yàn)的方法，分別用MTT法檢測了紅毛五加抗炎有效成分對OVCAR3細(xì)胞的毒性作用促凋亡作用，并以Hoechst染色法及流式細(xì)胞術(shù)測定法測定了紅毛五加中的乙醇提取物中純氯仿洗脫部分對OVCAR3細(xì)胞的促凋亡作用，結(jié)果初步證明了紅毛五加的抗腫瘤作用?？紤]到紅毛五加有效成分有抑制COX-2活性的作用，可以推測其促腫瘤細(xì)胞OVCAR3凋亡是通過抑制COX而實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)然本試驗(yàn)只是初步的抗腫瘤試驗(yàn)，而且是體外試驗(yàn)，至于在體是否有抗腫瘤作用還需進(jìn)一步的動物試驗(yàn)以驗(yàn)證。

總之，本實(shí)驗(yàn)證明紅毛五加抗炎有效成分，即紅毛五加中的乙醇提取物中純氯仿洗脫部分對OVCAR3細(xì)胞有促凋亡的作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典（上冊）[M]. 上海：上海科技出版社，1986：1018.

[2]呂曉英，李田，孫菊華.紅毛五加多糖誘導(dǎo)體外人胃癌細(xì)胞凋亡的研究[J].實(shí)用癌癥雜志，2001，16（1）：6-8.

[3]呂曉英，馬東瑞，李田，等.紅毛五加多糖對體外人胃癌細(xì)胞基因及細(xì)胞因子表達(dá)的影響[J].實(shí)用腫瘤雜志，2001，16（1）：45-46.

[4]呂曉英，蔣剛，蘇勉減. 紅毛五加多糖對體外人胃癌細(xì)胞的抑制作用特點(diǎn)及機(jī)制[J]. 腫瘤防治研究，2001，28（4）：256-258.

[5]王滿霞，張蒞峽，劉紅，等. 紅毛五加莖皮揮發(fā)油成分對體外培養(yǎng)人白血病粒細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究[J]. 中國中藥雜志，1994，19（9）：558-560.

[6]Dohadwala M，Luo J，Zhu L，et al. Non-small cell lung cancer cyclooxygenase-2-dependent invasion is mediated by CD44[J].J Biol Chem，2001，276（24）：20809-20812.

[7]Leahy KM，Ornberg RL，Wang Y，et al. Cyclooxygenase-2 inhibition by celecoxib reduces proliferation and induces apoptosis in angiogenic endothelial cells in vivo[J]. Cancer Res，2002，62（3）：625-631.

[8]Costa C，Soares R，Reis-Filho JS，et al. Cyclo-oxygenase 2 expression is associated with angiogenesis and lymph node metastasis in human breast cancer[J].J Clin Pathol，2002，55（6）：429-434.

[9]Shigemasa K，Tian X，Gu L，et al. Expression of cyclooxygenase-2 and its relationship to p53 accumulation in ovarian adenocarcinomas[J]. Int J Oncol，2003，22（1）：99-105.

[10]Landen CN Jr，Mathur SP，Richardson MS，et al. Expression of cyclooxygenase-2 in cervical，endometrial，and ovarian malignancies[J]. Am J Obstet Gynecol，2003，188（5）：1174-1176.

[11]Li S，Miner K，F(xiàn)annin R，et al. Cyclooxygenase-1 and 2 in normal and malignant human ovarian epithelium[J]. Gynecol Oncol，2004，92（2）：622-627.

[12]Denkert C，Kobel M，Pest S，et al. Expression of cyclooxygenase 2 is an independent prognostic factor in human ovarian carcinoma[J]. Am J Pathol，2002，160（3）：893-903.

[13]Creminon C，Habib A，Maclouf J，et al. Differential measurement of constitutive （COX-1） and inducible （COX-2） cyclooxygenase expression in human umbilical vein endothelial cells using specific immunometric enzyme immunoassays[J]. Biochim Biophys Acta，1995，1254（3）：341-348.

[14]Marx J. Cancer research Anti-inflammatories inhibit cancer growth--but how[J]. Science，2001，291（5504）：581-582.

[15]Mertz PM，DeWitt DL，Stetler-Stevenson WG，et al. Interleukin 10 suppression of monocyte prostaglandin H synthase-2. Mechanism of inhibition of prostaglandin-dependent matrix metalloproteinase production[J]. J Biol Chem，1994，269（33）：21322-21329.

（收稿日期：2012-06-05本文編輯：林利利）