王同華，陳衛(wèi)江，李 莓，王建喜，范連益，曲 亮，惠榮奎

（湖南省作物研究所，湖南 長沙 410125）

利用雜種優(yōu)勢是提高油菜生產(chǎn)水平的重要手段。育種實(shí)踐表明正確評價(jià)自交系間的親緣關(guān)系、遺傳差異及性狀互補(bǔ)等方面，對于雜種優(yōu)勢有效利用具有重要意義。但隨著育種材料的頻繁交流、育種方法的不斷創(chuàng)新，導(dǎo)致材料間的系譜關(guān)系相互交錯(cuò)程度大幅度提高，傳統(tǒng)的系譜分析法越來越難以滿足育種材料遺傳多樣性評價(jià)的需要。

分子標(biāo)記的出現(xiàn)為作物育種資源的遺傳多樣性分析提供了新的技術(shù)手段，特別是SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、重復(fù)性高、多態(tài)性高、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于作物的品種純度和真實(shí)性鑒定、指紋圖譜的繪制及遺傳多樣性分析等研究[1-5]。SSR標(biāo)記分析具有較高的穩(wěn)定性和可信度，是作物遺傳多樣性分析的首選分子標(biāo)記之一[6]。筆者以湖南省作物研究所選育的16份甘藍(lán)型油菜自交系為材料，通過SSR標(biāo)記分析評價(jià)其遺傳多樣性，以期為油菜種質(zhì)資源的有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料16份，均由湖南省作物研究所選育。其中pol-CMS不育系3份，pol-CMS恢復(fù)系11份，溫敏核不育系2份（表1）。

1.2 方法

1.2.1 播種與取樣 2011年9月底將16份供試材料播種于湖南省作物研究所試驗(yàn)田（上季作物為水稻），于苗期（7葉期左右）每份材料摘取5個(gè)單株的幼嫩葉片置于2 mL離心管中，-20℃保存。

1.2.2 SSR分析 基因組DNA提取參照Murry等[7]的方法進(jìn)行，并略有改進(jìn)。34對SSR引物序列均來自于http：//ukcrop.net（表2），由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系與循環(huán)參數(shù)參照陸光遠(yuǎn)等[8]報(bào)道的方法進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物在4%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察、拍照。

表1 16份供試油菜材料的名稱及來源

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)SSR電泳圖譜顯示的結(jié)果，按照各引物在相同電泳遷移率位置上PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶的有無進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),其中有帶記為1，無帶記為0，組成1和0的原始矩陣。采用生物學(xué)軟件NTSYS-pc2.10e進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，先利用SimQual程序計(jì)算材料間的遺傳相似系數(shù)（Genetic Similarity,GS），獲得相似系數(shù)矩陣，再用SHAN程序中的UPHMA進(jìn)行聚類分析，并通過Treeplot模塊生成聚類樹狀圖,并以簡單配對參數(shù)計(jì)算基因頻率。按照Nei提出的公式計(jì)算SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content,PIC），PIC=1-∑fi2，其中 fi為 i位點(diǎn)的基因頻率[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)性表現(xiàn)

34對SSR引物在16份供試油菜材料中共產(chǎn)生72條清晰的擴(kuò)增條帶，平均每對引物產(chǎn)生2.12條。擴(kuò)增條帶長度在100～650 bp之間，以150～350 bp的片段為主。圖1為引物CB10364和MR049對供試材料的SSR擴(kuò)增結(jié)果，其他引物的擴(kuò)增效果基本與該引物的擴(kuò)增效果相當(dāng)。在34對SSR引物中，28對引物的PCR擴(kuò)增條帶在供試材料中表現(xiàn)出明顯多態(tài)性，多態(tài)性比例為82.4%。多態(tài)性位點(diǎn)的PIC值在0.12～0.73之間，平均為0.39，其中以引物CB10427的最高（0.73），引物BnGMS633、BnGMS687、Na12-A02、Na12-E09、Na10-D11、Na10-D08的最低，平均為0.12。由此可見，研究選用的SSR引物具有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，也表明供試材料在這些位點(diǎn)存在較高的遺傳變異。

表2 SSR引物序列信息

圖1 引物CB10364和引物MR049對16份供試材料的SSR-PCR擴(kuò)增

2.2 聚類分析

利用生物學(xué)軟件NTSYS-pc2.10e對16份供試油菜材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明供試的16份材料可以被完全區(qū)分開，各材料間的遺傳相似系數(shù)在0.52～0.90之間，平均為0.63。其中，10個(gè)pol-CMS恢復(fù)系間的遺傳相似系數(shù)在0.52～0.90之間，平均為0.61；3個(gè)pol-CMS不育系間遺傳相似系數(shù)在0.71～0.86之間，平均為0.79；2個(gè)溫敏核不育系間的遺傳相似系數(shù)為0.90。如圖2所示，在遺傳相似系數(shù)為0.685時(shí)，供試材料可分為A、B、C 3個(gè)類群。A類群包含7份材料（5份pol-CMS恢復(fù)系、2份溫敏核不育系）；B類群包含8份材料（4個(gè)pol-CMS不育系、4個(gè)pol-CMS恢復(fù)系）；C類群僅包含1份pol-CMS恢復(fù)材料。研究結(jié)果表明，在16份供試材料中，pol-CMS恢復(fù)系材料間存在較好的遺傳多樣性，pol-CMS不育系材料間的遺傳多樣性相對較差，2份溫敏核不育系材料的遺傳背景非常相近。

3 討論

研究利用選取的34對SSR引物對16份供試油菜育種材料進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果表明在供試材料中，pol-CMS恢復(fù)系材料間具有較好的遺傳多樣性，而pol-CMS不育系材料與溫敏核不育系材料的遺傳多樣性較狹窄。該結(jié)果可能與以上育種材料的選育方法密切相關(guān)，研究中pol-CMS恢復(fù)系大多通過同質(zhì)恢復(fù)系進(jìn)行選育，即通過已有雜交組合直接自交純合，或利用已有的pol-CMS恢復(fù)系材料直接回交轉(zhuǎn)育，其恢復(fù)系材料的遺傳基礎(chǔ)易于拓展，遺傳背景相對廣泛。而pol-CMS不育系的選育主要源于對已有不育系的回交改良，該類型不育系存在不同程度的低溫敏感現(xiàn)象，因此pol-CMS不育系的選育對核心親本的依賴性較強(qiáng)，往往幾個(gè)不育系均含一個(gè)核心不育系的血緣。另外，研究中溫敏核不育系材料由于受多對隱性基因控制，新型系轉(zhuǎn)育更為困難，研究供試的2個(gè)溫敏核不育系均來源于隱性核不育系86A后代分離群體，有著明顯的遺傳相似性。

對16份供試材料的聚類結(jié)果表明，來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料研究所中油雜系列的Z2R、Z8R優(yōu)先聚到一起，來源于隱性核不育系86A的91S、402S優(yōu)先聚到一起，含有SC4的血緣的169A與SC4優(yōu)先聚到一起，通過品質(zhì)改良17A選育的不育系167A與17A也優(yōu)先聚到一起。這充分說明SSR揭示的遺傳多樣性與地理來源和系譜來源基本一致，可以充分反映材料間的遺傳差異。在該研究中恢復(fù)系95-5單獨(dú)聚為一類，與其他材料間具有明顯的遺傳特異性，而在表型上該恢復(fù)系確實(shí)具有土黃色花瓣、種皮自然開裂等非常特殊的農(nóng)藝性狀，需注意對該特異種質(zhì)資源的保存和利用。由此可見，SSR聚類結(jié)果較好地反映了材料間的親緣關(guān)系，可為育種資源的有效利用提供參考。

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