徐建明，何永忠，雷 鳴，吳文起，李 遜，黃錦昆，楊后猛，桂志明，鐘 文，李 天，曾國華，李舒玨

(廣州醫(yī)學(xué)院港灣醫(yī)院廣東省泌尿外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510230)

當(dāng)前的流行病學(xué)研究顯示，前列腺癌在歐美國家的發(fā)病率明顯高于我國，已經(jīng)成為男性惡性腫瘤的第一位，而我國的前列腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)[1]。前列腺特異抗原(PSA)是一種包含240個(gè)氨基酸的單鏈糖蛋白，分子量為34 kD。正常前列腺上皮、增生前列腺組織及前列腺癌細(xì)胞均能產(chǎn)生PSA。但在前列腺癌患者PSA水平明顯高于良性前列腺增生患者及正常老年人。PSA在前列腺癌篩選、診斷、治療方法的選擇、療效評(píng)估以及監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)等方面已廣為應(yīng)用[2-3]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在多種生物細(xì)胞內(nèi)，由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)同源序列mRNA的特異性降解，而導(dǎo)致的基因沉默現(xiàn)象[4]。隨著RNA干擾技術(shù)的興起與發(fā)展，特異性地使某個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄后沉默成為可能，因而成為前列腺癌基因治療的又一新的有前途的靶向策略[5]。

我們采用RNA干擾技術(shù)阻斷PSA基因表達(dá)，減少PSA的形成，降低其活性，研究PSA基因表達(dá)受抑制后對(duì)LNCaP細(xì)胞的生長、增殖及調(diào)亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP由廣東省泌尿外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司；特異性干擾RNA由上海吉瑪公司合成；TurboFect? siRNATransfection Reagent購自Ferments公司；兔抗人PSA抗體購自EPITOMICS公司；四氮甲基唑藍(lán)(MTT)購自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞的凍存和培養(yǎng) 人雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細(xì)胞株由廣東省泌尿外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 干擾RNA的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 根據(jù)人PSA基因序列及文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合siRNA的設(shè)計(jì)原理提交上海吉瑪公司合成PSA siRNA序列：正義鏈，5'-GUGCGAGAAGCAUUCCCAATT-3'；反義鏈，5'-UUGGGAAUGCUUCUCGCACTT-3'。陰性對(duì)照序列：正義鏈，5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；反義鏈，5'-ACGUGACACGUUCGGAGA-3'。用TurboFectTMsiRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染液將PSA-siRNA及陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)入LNCaP細(xì)胞，具體的操作步驟按TurboFect?siRNATransfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

1.4 蛋白印跡檢測(cè)PSA的變化 轉(zhuǎn)染后48 h取對(duì)數(shù)生長期的LNCaP細(xì)胞，提取總蛋白并定量，蛋白印跡(Western blot)檢測(cè)PSA的表達(dá)，以GAPDH的表達(dá)作為內(nèi)參，并利用PHOTOSHOP圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.5 MTT法檢測(cè)LNCaP細(xì)胞的生長與增殖取對(duì)數(shù)生長期的LNCaP細(xì)胞以1×106/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，分4組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染組(siPSA)、陰性對(duì)照組(NC)、轉(zhuǎn)染液組(Transfection)和對(duì)照組(Control)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后，每孔按10%的體積比加入5 mg/ml MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，每孔加入100μl的DMSO，然后以490 nm波長經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度(OD)值，并計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)形態(tài)學(xué)分析 轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞并用PBS漂洗，進(jìn)行Annexin-V-FITC-PI熒光染色，制成單細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PSA-siRNA轉(zhuǎn)染后LNCaP細(xì)胞中PSA的表達(dá) 蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果顯示與空白組相比，PSA-siRNA轉(zhuǎn)染48 h后。轉(zhuǎn)染組LNCaP細(xì)胞株內(nèi)PSA的表達(dá)明顯降低，轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染液組及對(duì)照組LNCaP細(xì)胞株內(nèi)PSA的表達(dá)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染液組和對(duì)照組比較，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖1)。

2.2 MTT分析PSA-siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)LNCaP細(xì)胞生長與增殖的抑制作用與陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染液組和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染48 h后PSA-siRNA轉(zhuǎn)染組的LNCaP細(xì)胞數(shù)減少約27.5%(表1)。

圖1 轉(zhuǎn)染48 h后LNCaP細(xì)胞中PSA及GAPDH的蛋白印跡分析結(jié)果

表1 轉(zhuǎn)染48 h后LNCaP細(xì)胞增殖情況[細(xì)胞個(gè)數(shù)（%）]

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PSA-siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)LNCaP細(xì)胞調(diào)亡的影響 與陰性對(duì)照組、空白載體轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染48 h后轉(zhuǎn)染組的LNCaP細(xì)胞調(diào)亡率約為19.3%(表2、圖2)。

表2 轉(zhuǎn)染48 h后LNCaP細(xì)胞調(diào)亡率（%）

圖2 轉(zhuǎn)染后流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

迄今對(duì)于處于進(jìn)展期和晚期的前列腺癌仍沒有有效的治療方法。對(duì)于中晚期的前列腺癌，目前可以選擇的治療方法有內(nèi)分泌治療、化學(xué)治療、放射治療，而基因治療是目前的研究熱點(diǎn)。盡管目前基因治療的方法和途徑多種多樣，但是仍然沒有發(fā)現(xiàn)十分有效的治療方法，故而各國學(xué)者一直沒有中斷尋找更為有效的基因治療方法。

PSA是一種酸性糖蛋白酶，由240個(gè)氨基酸多肽單鏈與4個(gè)碳水鍵構(gòu)成，相對(duì)分子量為33000～34000。控制PSA基因位于19號(hào)染色體長臂上，含5個(gè)外顯子、4個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)啟動(dòng)子。PSA有調(diào)節(jié)生長因子的作用，在惡性細(xì)胞中的含量明顯高于正常和增生的細(xì)胞，已經(jīng)作為公認(rèn)的前列腺癌腫瘤標(biāo)記物有20余年的歷史。

RNAi現(xiàn)象最早在1998年由Fire等[6]發(fā)現(xiàn)并命名。隨后的研究發(fā)現(xiàn)RNAi機(jī)制廣泛存在于線蟲、果蠅、斑馬魚、真菌、植物以及哺乳動(dòng)物等生物體內(nèi)，這些生物體利用RNAi來抵御病毒的感染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。之后RNA干擾技術(shù)成為基因治療研究的熱點(diǎn)。siRNA是一類長度為21～23 nt的小片段雙鏈RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)，siRNA可特異識(shí)別有靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，并切割其中與siRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而抑制靶基因的表達(dá)[7]。利用這種RNA干擾技術(shù)封閉某些目的基因，阻止相應(yīng)蛋白的表達(dá)，不僅具有理論意義，而且具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[8]。

本研究運(yùn)用化學(xué)合成法構(gòu)建了針對(duì)PSA基因的小分子干擾RNA(PSA-siRNA)，將PSA-siRNA轉(zhuǎn)染入LNCaP細(xì)胞，并設(shè)立了陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染液組和對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，PSA-siRNA轉(zhuǎn)染組的LNCaP細(xì)胞的生長與增殖受到明顯抑制，LNCaP細(xì)胞的調(diào)亡顯著增加。而陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染液組和對(duì)照組差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此我們可知，針對(duì)PSA基因的siRNA具有一定的特異性。

蛋白印跡顯示PSA蛋白表達(dá)在siPSA組明顯降低，MTT分析結(jié)果顯示siPSA組的細(xì)胞生長受到明顯抑制，流式細(xì)胞儀檢測(cè)siPSA組的調(diào)亡率更高。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，PSA-siRNA可以抑制LNCaP細(xì)胞的生長與增殖，并增加調(diào)亡，為前列腺癌的RNA干擾治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)，其機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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[4]繆應(yīng)業(yè),劉家云,田晉洪,等.RNA干擾技術(shù)及其在前列腺癌基因治療研究中的應(yīng)用[J].國際泌尿系統(tǒng)雜志,2006,26(2):169-172.

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