蔣翡翎，單保恩，姚 敏，魏小斌，伍 燕，鄧碧蘭

(1.?？谑腥嗣襻t(yī)院檢驗科，海南 ?？?5702082.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北 石家莊 050011)

我們前面已有實驗證明活卡介苗(BCG)的有效組分BCGE2和BCGE3在體外可以誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細胞增殖及產(chǎn)生細胞因子[1]，并且BCGE2和BCGE3還可以誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO[2]，因此BCGE2和BCGE3可以作為免疫調(diào)節(jié)劑來誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細胞和腹腔巨噬細胞。那么這些經(jīng)誘導(dǎo)激活的小鼠脾淋巴細胞對腫瘤細胞是否具有殺傷或抑制作用呢？本研究旨在將人膀胱癌細胞株T24作為靶細胞對BCGE2的體外抗腫瘤活性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡的昆明小鼠、體重18～22 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑 BCG購于北京生物制品研究所，胎牛血清為杭州四季青生物工程材料公司生產(chǎn)，Sephadex G100凝膠層析柱購自Sigma公司，RPMI1640為GIBCO公司產(chǎn)品，Gress試劑購自華美生物公司，腫瘤細胞株T24由河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院科研中心提供。

1.3 BCG蛋白提取液的制備及蛋白含量測定 用酶裂解法和超聲波破碎法對活BCG進行裂解，用紫外吸收法測定其上清液中蛋白質(zhì)(BCGE)的純度；用考馬斯亮藍G250法測定蛋白含量。

1.4 BCGE蛋白活性組分的分離 將BCGE上樣于Sephadex G100凝膠層析柱，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫，每管收集2 ml層析液，分離后得到3個組分，分別命名為 BCGE1、BCGE2和 BCGE3，其相對分子質(zhì)量分別為42500 D、36300 D和28600 D。

1.5 腫瘤細胞株懸液制備 腫瘤細胞株T24細胞培養(yǎng)在RPMI1640完全培養(yǎng)液中，置于37℃，飽和濕度，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后收集細胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整成濃度為1×105個/ml的細胞懸液備用。

1.6 脾效應(yīng)細胞懸液制備 無菌取小鼠脾臟，在200目鋼篩上研磨，制備成單個細胞懸液，離心，棄上清，裂解紅細胞后用Hank's液洗兩次，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度為3.5×106個/ml。然后接種于24孔板，加入RPMI1640配制的BCGE2并調(diào)節(jié)使其終濃度為600μg/ml，作用48 h后收集細胞(對照組加RPMI1640培養(yǎng)液)，用臺酚蘭染色計算存活率為90%，后用D-Hank's液洗滌后調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml。

1.7 淋巴細胞殺傷功能測定 參照改良四甲基偶氮唑鹽比色法MTT法[3]，實驗孔加待測的經(jīng)BCGE2作用后的小鼠脾效應(yīng)細胞懸液與T24細胞懸液各100 μl，調(diào)節(jié)效靶比為5:1、10:1、20:1(陰性對照組加入未經(jīng)BCGE2作用的小鼠脾淋巴細胞懸液與T24細胞懸液，各100 μl，并調(diào)節(jié)效靶比為5:1、10:1、20:1)，另設(shè)單純淋巴細胞(效應(yīng)細胞)及T24細胞(靶細胞)對照，均設(shè)6個復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，加入MTT 100μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，每孔加入15%十二烷基磺酸鈉(SDS)100μl，過夜。次日用酶標儀檢測各孔吸光度(OD)值，測定波長為570 nm，參考波長為630 nm。計算淋巴細胞的殺傷活性。其計算公式為：淋巴細胞活性(%)=[靶細胞對照組OD值-(實驗組OD值-效應(yīng)細胞OD值)]/靶細胞對照組OD值×100%。

2 結(jié)果

鏡下可見，對照組的膀胱癌細胞布滿整個視野，加入效靶比為20:1的實驗組，膀胱癌細胞顯著減少，見圖1。BCGE2體外可誘導(dǎo)和促進小鼠脾淋巴細胞對T24的殺傷作用。由表1結(jié)果可見，未經(jīng)BCGE2誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞對膀胱癌細胞株僅具有較輕微的殺傷作用，在效靶比為20:1時其抑制率才達到13.32%。而經(jīng)BCGE2誘導(dǎo)后的小鼠脾淋巴細胞對膀胱癌細胞株T24的殺傷作用顯著增強(P＜0.01)，在效靶比為10:1時其抑制率為31.49%，當效靶比為20:1時其抑制率可高達42.31%。

圖1 膀胱癌T 24細胞的鏡下形態(tài)(×200)

表1 BCGE2體外誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞對膀胱癌T 24細胞的殺傷作用

3 討 論

卡介苗是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它可通過調(diào)節(jié)外周血CD4+/CD8+比例及自然殺傷細胞(NK細胞)活性來發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，進一步維持和提高機體的免疫功能[4]。而NK細胞主要發(fā)揮非特異性殺傷活性，無需抗原預(yù)先致敏即能自發(fā)殺傷靶細胞且不受主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制，因此NK細胞是機體抗腫瘤的第一道防線。NK細胞釋放的殺傷介質(zhì)穿孔素、NK細胞毒因子等可使靶細胞溶解破裂。NK細胞還可通過抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用(ADCC)效應(yīng)，殺傷被特異性抗體包被的瘤細胞，其機理為通過IgG1和IgG2抗體作橋梁，其Fab端特異性識別腫瘤，F(xiàn)c段與NK細胞FcRgⅢa結(jié)合，產(chǎn)生抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用。NK細胞也可以將顆粒酶經(jīng)穿孔素在靶細胞上形成的“孔洞”注入靶細胞從而使靶細胞DNA斷裂而導(dǎo)致細胞凋亡[5]，因此NK細胞在抗腫瘤免疫中起重要作用。而腫瘤患者中的NK細胞的百分率往往是降低的，預(yù)示機體NK細胞作用受抑制,不能有效發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用[6]。有研究表明BCG可以直接通過TLRs激活NK細胞[7]，使其直接對腫瘤細胞進行殺傷。NK細胞通過識別腫瘤抗原與靶細胞結(jié)合，結(jié)合后微管插入細胞膜，釋放NK細胞溶瘤因子(NKCF)，NK細胞還可通過多次接觸多個腫瘤細胞放大殺傷效應(yīng)[8-9]。本研究結(jié)果也證實，經(jīng)BCGE2體外誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞對腫瘤細胞株T24的殺傷活性顯著增強(由于未預(yù)先采用抗原致敏，其活性細胞大多數(shù)為NK細胞)。未經(jīng)BCGE2誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞對膀胱癌細胞株僅具有較輕微的殺傷作用，在效靶比為20:1時其抑制率才達到13.32%。而經(jīng)BCGE2誘導(dǎo)后的小鼠脾淋巴細胞對膀胱癌細胞株T24的殺傷作用顯著增強(P＜0.01)，并隨著效靶比的增加而更為顯著，提示BCGE2具有間接的抗腫瘤作用。

[1]蔣翡翎,單保恩,張淑芳,等.卡介苗提取物對小鼠脾淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)作用的體外實驗研究[J].中華腫瘤防治雜志,2007,14(11):827-829.

[2]蔣翡翎,單保恩,姚 敏,等.卡介苗蛋白提取物體外對小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2010,45(4):621-623.

[3]Tada H,Shiho OK,Kuroshima K,et al.An improved colorimetric assay for interleukin 2[J].JImmunol Meth,1986,93:157

[4]黃 捷,賴偉珍,韓紅星,等.卡介菌多糖核酸對梅毒血清固定患者外周血T淋巴細胞亞群的影響[J].海南醫(yī)學(xué),2007,18(7):17-18.

[5]Pardo J,Balkow S,Anel A,et al.Granzymes are essential for natural killer cell-mediated and perf-facilitated tumor control[J].Eur J Immunol,2002,32(10):2881-2887.

[6]蘇 杭,吳曉蔓.肝癌患者外周血淋巴細胞亞群及活化狀態(tài)的臨床意義[J].海南醫(yī)學(xué),2004,15(10):105-106.

[7]Suttmann H,Jacobsen M,Reissk,et al.Mechanisms of bacillus calmette-Guérin mediated natural killer cell activation[J].2004,172:1490-1495.

[8]Berzofsky JA,Terabe M.The contrasting roles of NKT cells in tumor immunity[J].Curr Mol Med,2009,9(6):667-672.

[9]Uemura A,Takehara T,Miyaqi T,et al.Natural killer cell is a major producer of interferon gamma that is critical for the IL-12-induced anti-tumor effect in mice[J].Cancer Immunology immunotherapy,2010,59(3):453-463.