鄭旭銳 李長秦 季金文 王禮鳳 孫守才 宋 健 王小平 肖新春 陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽 712046）

加味四逆散是抗肝纖維化有效的中藥復(fù)方，我們?cè)谇捌诘难芯恐幸呀?jīng)證實(shí)其具有良好的抗肝纖維化作用［1－5］，為了進(jìn)一步探討其抗肝纖維化的機(jī)制，我們此次以肝星狀細(xì)胞（HSC）為靶點(diǎn)，研究該方對(duì)HSC增殖的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性SD大鼠30只，清潔級(jí)，體重180g±20g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK－（軍）2007－007。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥物：加味四逆散：柴胡、枳殼、桃仁各10g，白芍20g，姜黃30g，丹參25g，黃芪40g。以上藥物均購自陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，藥物經(jīng)加水浸泡，常規(guī)煎煮，過濾，水浴蒸發(fā)至3.12g／mL濃度的藥液；復(fù)方鱉甲軟肝片：0.5g／片，批號(hào)：20100808，用蒸餾水溶解至0.625g／mL。

1.1.3 動(dòng)物細(xì)胞：HSC－T6（大鼠肝星狀細(xì)胞）：購自上?？蠌?qiáng)儀器有限公司，編號(hào)zy1002。

1.1.4 主要試劑：RPMI－1640干粉培養(yǎng)基（美國Gibco公司，按每10.4g 1640干粉培養(yǎng)基溶于900mL雙蒸水，待其分溶解，加入青霉素100U／mL，硫酸鏈霉素I00U／mL，用1mol／L NaOH調(diào)節(jié)PH至7.1～7.4，定容至1000mL，采用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4℃冰箱保存）；胰蛋白酶（美國Sigma，進(jìn)口分裝，濃度為1：250，即0.25%，用胰蛋白酶0.25g，PBS100mL，充分溶解，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4℃冰箱保存。臨用時(shí)用無菌的7.4%NaHCO3調(diào)節(jié)PH至7.2左右）；胎牛血清（FBS，鄭州益康生物工程有限公司）；二甲基亞楓（DMSO，美國Sigma公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國Sigma公司）

1.1.5 主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（德國Bind CB－150）；電子精密天平（BS124S型，北京賽多科斯儀器系統(tǒng)有限公司）；超低溫冰箱（美國熱電702型）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio－Tek ELX808IU）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1 分組：將30只實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組；加味四逆散低濃度組；加味四逆散中濃度組；加味四逆散高濃度組；復(fù)方鱉甲軟肝片組，每組均6只。

1.2.2 制備含藥血清：空白對(duì)照組每只按1mL／100g給予生理鹽水灌胃，1次／d；加味四逆散低濃度組每只按1mL／100g（每毫升含生藥量0.78g）灌胃，1次／d；加味四逆散中濃度組每只按1mL／100g（每毫升含生藥量1.56g）灌胃，1次／d；加味四逆散高濃度組每只按1mL／100g（每毫升含生藥量3.12g）灌胃，1次／d；復(fù)方鱉甲軟肝片組每只按1mL／100g（每毫升含生藥量0.625g）灌胃，1次／d；以上各組大鼠均連續(xù)灌胃7d。最后一次灌藥（灌藥前禁食不禁水12h）1h后，每只大鼠按0.35mL／100g給予10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心分離血清，56℃水浴中滅活30min，0.45um微孔濾膜過濾，－20℃冷藏備用。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代：HSC－T6以含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)于含5%CO2、飽和濕度為37℃環(huán)境中。RPMI－1640中含100U／mL青霉素、100U／mL硫酸鏈霉素，每2d傳代1次。培養(yǎng)方法：本實(shí)驗(yàn)的HSC－T6是原代細(xì)胞，將HSCT6細(xì)胞于37℃快速復(fù)蘇，常規(guī)0.4%臺(tái)昐藍(lán)拒染法進(jìn)行細(xì)胞活力鑒定，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)成（0.5～1）×105／L的濃度并接種在100mL培養(yǎng)瓶中，于5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)1～3d，當(dāng)細(xì)胞完全貼壁后換液，以后每3～4d換1次培養(yǎng)液。每隔4～8h用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)。

當(dāng)細(xì)胞生長至80%左右匯合后傳代，吸取全部細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗1～2次，滴加37℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶1～2mL，以液面覆蓋細(xì)胞為宜。轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰酶鋪滿培養(yǎng)瓶底，顯微鏡下觀察胞質(zhì)回縮，胞間間隙增大時(shí)快速吸取胰酶，滴加5mL培養(yǎng)液，終止消化，反復(fù)輕柔吹打10～15次，使成單細(xì)胞懸液，以1∶2或1∶3稀釋后傳代，培養(yǎng)24h換液，48h再次傳代。

1.2.4 MTT比色法檢測(cè)藥物對(duì)HSC－T6增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長期HSC－T6，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×104個(gè)細(xì)胞／mL，將調(diào)整濃度后的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12h；細(xì)胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)液，分組加入藥物血清?？瞻讓?duì)照組加入生理鹽水大鼠血清0.5mL；加味四逆散低濃度組、加味四逆散中等濃度組、高濃度組分別加入不同濃度加味四逆散大鼠藥物血清0.5mL；復(fù)方鱉甲軟肝片組加入鱉甲軟肝片大鼠藥物血清0.5 mL；以上各組每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，處理12h、24h、48h。每孔加入5mg／mL的MTT液20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸出上清液，每孔加入DMSO150μL混均，震蕩10min使紫藍(lán)色沉淀充分溶解，用酶標(biāo)儀（ELX808IU型）在490nm波長檢測(cè)各孔吸光度值（OD值）。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值；抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組平均OD值／對(duì)照組平均OD值）×100%，計(jì)算抑制率。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)樣本的比較采用單因素方差分析，多個(gè)樣本的兩組間比較采用SNK－q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 不同濃度加味四逆散藥物血清作用生長良好的肝星狀細(xì)胞12h、24h、48h后，MTT比色法顯示隨加味四逆散含藥血清濃度的增加，HSC490nm波長處吸光度值（OD值）逐漸降低，抑制率上升，呈現(xiàn)量效與時(shí)效關(guān)系。藥物組細(xì)胞抑制率明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01）；加味四逆散低、中、高濃度組與鱉甲軟肝片組相比較，除低、中濃度組作用12h、24h時(shí)無差異（P＞0.05）外，其余濃度組均優(yōu)于鱉甲軟肝片組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞490nm波長處吸光度值與加味四逆散作用時(shí)間和濃度的關(guān)系，見表1。

表1 不同濃度加味四逆散藥物血清對(duì)HSC增殖的影響（）

表1 不同濃度加味四逆散藥物血清對(duì)HSC增殖的影響（）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.01；與鱉甲軟肝片組比較，▲P＜0.05，◇P＞0.05

3 討 論 不同病因?qū)е赂卫w維化的共同途徑是肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活，HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），ECM在肝內(nèi)大量沉積，導(dǎo)致肝纖維化形成。有報(bào)道人HSC活化增殖時(shí)Ⅰ型膠原mRNA為靜止時(shí)的60～70倍［6］，故 HSC活化增殖是肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［7］，HSC活化增值是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。體外培養(yǎng)的HSC可自發(fā)活化，目前是體外研究藥物抗肝纖維化較為理想的模型。我們此次以HSC為靶點(diǎn)，用中藥復(fù)方加味四逆散藥物血清為干預(yù)因素，研究該藥對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖的影響。

復(fù)方鱉甲軟肝片在臨床上用于治療HF已經(jīng)得到公認(rèn)，并且體外研究已明確其對(duì)肝纖維化早期有明顯阻斷作用，并可抑制HSC活化、增殖及ECM的形成，從而阻止慢性肝病肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展［8］。因此我們選用復(fù)方鱉甲軟肝片作為陽性對(duì)照組。

本研究用MTT檢測(cè)法觀察加味四逆散含藥血清對(duì)HSC增殖的影響，吸光度值能間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果表明加味四逆散含藥血清能顯著抑制HSC增殖，隨作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長，490nm波長處吸光度值逐漸降低，抑制率上升，呈現(xiàn)量效和時(shí)效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01）；加味四逆散低、中、高濃度組與鱉甲軟肝片組比較，除低、中濃度組作用12h、24h時(shí)無差異（P＞0.05）外，其余濃度組均優(yōu)于鱉甲軟肝片組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究結(jié)果提示加味四逆散可以抑制HSC增殖，這可能是其抗肝纖維化的途徑之一。

［1］李長秦，胡建軍，鄭旭銳，等.加味四逆散對(duì)肝纖維化大鼠肝組織ⅠⅢ型膠原含量的影響［J］.陜西中醫(yī)，2004，25（9）：852－854.

［2］李長秦，鄭旭銳 孫守才，等.加味四逆散肝纖維化大鼠肝組織Ⅳ型膠原和轉(zhuǎn)化生長因子β1影響的免疫組化研究［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，27（3）：25－27.

［3］鄭旭銳，孫守才，李長秦.加味四逆散治療肝纖維化量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2008，28（5）：25－27.

［4］鄭旭銳，孫守才，韋永紅，等.加味四逆散對(duì)肝纖維化大鼠肝組織Ⅰ，Ⅲ型膠原mRNA影響的研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（8）：1923－1924.

［5］鄭旭銳，孫守才，李長秦，等.加味四逆散對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGFβ1、CTGFmRNA影響的研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（10）：2597－2598.

［6］董培紅，何生松，蘇 剛，等.內(nèi)毒素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞活化和瘦素表達(dá)的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，15（2）：156－158.

［7］Iredale JP，Benyon RC，Pickering J，et al.Mechanisms of spontaneous resol－Ution of rat liver fibrosis.Hepatic stellate cell apoptosis and reduced hepaticexpression of metalloproteinase inhibitors.J Clin Ivest，1998，102：538－549.

［8］趙景明，周光德，李文淑，等.復(fù)方鱉甲軟肝片抗肝纖維化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2004，29（7）：560－562.