張建華，施恒亮，翟艷華，俞華莉，曹讓娟，朱筱娟

（東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春13 0024）

兔抗MyosinⅩ多克隆抗體的制備及初步應(yīng)用

張建華，施恒亮，翟艷華，俞華莉，曹讓娟，朱筱娟

（東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130024）

為制備兔抗肌球蛋白Ⅹ（m y o s i nⅩ，M y oⅩ）多克隆抗體，合成了含有M y oⅩN端1000～1021個氨基酸的多肽，將純化后的多肽與鑰孔戚血藍(lán)蛋白（k e y h o l e l i m p e t h e m o c y a n i n，K LH）進(jìn)行交聯(lián)；通過背部皮下免疫新西蘭大白兔獲得免疫血清，并通過E L I S A、免疫印跡、免疫熒光等分析對免疫血清進(jìn)行了初步的驗(yàn)證．結(jié)果表明：經(jīng)過4次免疫后可獲得免疫血清，E L I S A檢測表明抗體終效價達(dá)到1∶51200，抗原吸附實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了此多克隆抗體的特異性．利用獲得的多克隆抗體檢測了多種組織中M y oⅩ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兔抗M y oⅩ多克隆抗體可特異性識別多種組織中的M y oⅩ．免疫熒光染色表明該抗體可以顯示M y oⅩ在C O S－7細(xì)胞、N L T細(xì)胞和神經(jīng)元中的分布．

肌球蛋白Ⅹ；多克隆抗體；半抗原

1 材料與方法

1．1 動物

新西蘭大白兔，由北京華阜康動物中心提供，雌性，體重約2k g．

1．2 M y oⅩ分子N端多肽抗原的合成

參考H i r o s h i T o k u o和M i t s u o I k e b e的報道［10］，根據(jù)M y oⅩN端1000～1021氨基酸序列設(shè)計并合成多肽作為半抗原，多肽序列為N′－D D D D A F K D S P N P S HE GH S D QR T S－C′．免疫用抗原為C端交聯(lián)載體蛋白K LH的完全抗原，由上海吉爾生化有限公司完成．合成多肽14μg，取其中10μg與K LH交聯(lián)用于免疫動物，4μg非偶聯(lián)的半抗原用于E L I S A檢測抗血清效價．弗氏佐劑和羊抗兔

I g G－HR P為S i g m a公司產(chǎn)品．E C L反應(yīng)試劑盒為G E－H e a l t h c a r e公司產(chǎn)品．

1．3 兔抗M y oⅩ多克隆抗體的制備

將完全抗原1m g溶于1m L P B S中，并與等體積的弗氏佐劑進(jìn)行充分的乳化．將乳化后的抗原進(jìn)行背部多點(diǎn)皮下注射免疫新西蘭大白兔．首次免疫后2周加強(qiáng)免疫1次，第三次免疫之前進(jìn)行耳緣靜脈取血，采用E L I S A檢測效價以確定加強(qiáng)免疫的次數(shù)．首次免疫采用完全弗氏佐劑，加強(qiáng)免疫均使用不完全弗氏佐劑．最后一次加強(qiáng)免疫后一周頸動脈放血，收集血液于4℃過夜，析出血清；10000r／m i n，4℃，離心10m i n，分離血清．

1．4 E L I S A檢測抗血清效價

用10μg／m L的半抗原包被96孔板，每孔100μL，4℃孵育過夜后，用P B S T洗滌3次，每次4m i n；用10%（w／v）脫脂奶粉－P B S進(jìn)行封閉，每孔150μL，37℃孵育1h；每孔加入用P B S倍比稀釋的抗血清100μL（對照為未免疫兔血清），37℃孵育1h；洗滌，每孔加入1∶10000稀釋的HR P標(biāo)記的羊抗兔I g G 100μL，37℃孵育1h，洗滌3次后進(jìn)行TMB顯色，37℃孵育15 m i n，終止反應(yīng)后，測定樣品的D（450）值．

1．5 M y oⅩ多克隆抗體的特異性分析

1．5．1 組織蛋白的提取

用R I P A裂解液（含10 m L／L N P－40，50 mm o l／L N a C l，P B S（p H＝7．2），2 mm o l／L E D TA， 50mm o l／L氟化鈉，0．2mm o l／L膽礬酸鈉，蛋白酶抑制劑）裂解鼠腦、心、肝、肺、腎、皮膚等組織，冰上孵育30m i n．其間每間隔5m i n用渦旋振蕩器振蕩一次，此后離心（10000r／m i n，4℃，10m i n），收集上清獲得組織蛋白．同樣方法獲得腫瘤SW 480和SW 620的蛋白抽提液．

1．5．2 免疫印跡分析

取含15μg總蛋白的裂解液，加入S D S－P AG E樣品緩沖液，100℃加熱煮沸5m i n后，進(jìn)行常規(guī)的S D S－P AG E電泳，分離膠濃度為8%．電泳結(jié)束以后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至P V D F膜上，用5%（w／v）脫脂奶粉室溫封閉1h；加入1∶3000稀釋的兔抗M y oⅩ多克隆抗體，室溫下孵育1h；P B S T緩沖液洗膜后，加入羊抗兔I g G－HR P抗體，室溫下孵育1h；P B S T緩沖液洗滌膜后，E C L法顯色．

1．5．3 免疫熒光染色

將蓋玻片用3%冰醋酸浸泡30m i n后沖洗，再用75%的酒精浸泡1h以上，自來水沖洗干凈，曬干．將細(xì)胞按1×105個／m L的數(shù)量鋪到已包被蓋玻片的12孔板中，37℃溫箱中培養(yǎng)12～24h后吸掉培養(yǎng)基；用預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定10m i n；用含0．2%T r i t o n的P B S室溫打孔10m i n；用2%B S A室溫封閉1h；加入以1∶1000的比例稀釋的兔抗血清，室溫反應(yīng)1h，P B S洗滌3次，每次5m i n；用P B S以1∶5000的比例稀釋二抗，室溫反應(yīng)1h，P B S洗滌3次，每次5m i n；去離子水洗滌兩次，每次5m i n； 75%甘油（P B S稀釋）封片，顯微鏡觀察，拍照記錄結(jié)果．

2 結(jié)果

2．1 半抗原的合成及偶聯(lián)

應(yīng)用P l o t o f P r o t e i n H y d r o p a t h i c P r o f i l e軟件對M y oⅩ序列的親水性進(jìn)行分析（見圖1 A），根據(jù)親水性分析曲線，設(shè)計并合成含有M y oⅩN端21個氨基酸的多肽作為半抗原；經(jīng)高效液相色譜純化以后的多肽純度為95．27%（見圖1 B），半抗原的氨基酸序列為M y oⅩ分子N端1000～1021氨基酸（見圖1 C）．

圖1 多肽序列的選擇及純度分析

2．2 兔抗M y oⅩ多克隆抗體的效價分析

經(jīng)4次動物免疫后，用E L I S A進(jìn)行效價測定，半抗原檢測效價達(dá)到1∶6400，說明抗血清可以與多肽半抗原發(fā)生抗原抗體反應(yīng)．全抗原檢測效價達(dá)到1∶51200，說明進(jìn)行K LH偶聯(lián)后加強(qiáng)了半抗原的免疫原性．

2．3 兔抗M y oⅩ多克隆抗體的特異性分析

取胎齡16．5d的鼠腦組織，分別用免疫前血清、免疫后按1∶5000稀釋的免疫血清和經(jīng)M y oⅩ抗原吸附后的免疫血清（5m L，按1∶1000稀釋后的抗血清中加入2m g偶聯(lián)的多肽抗原室溫反應(yīng)1h）進(jìn)行W e s t e r n b l o t分析，檢測免疫血清的特異性．如圖2所示，左泳道是免疫前的兔血清，可見免疫前的兔血清不能識別M y oⅩ相應(yīng)的條帶；中間泳道是免疫后的免疫血清，可以檢測到分別與M y oⅩ的全長形式和無頭形式相對應(yīng)的兩個條帶，相對分子質(zhì)量分別為240000和165000，與文獻(xiàn)報道相符；右泳道是進(jìn)行抗原吸附后的免疫血清，由于抗原中和，免疫血清喪失識別抗原能力，因此，檢測不到與M y oⅩ的全長和無頭形式相對應(yīng)的兩個條帶．以上實(shí)驗(yàn)說明抗血清可以特異性識別和結(jié)合M y oⅩ抗原．

圖2 兔抗M y oⅩ多克隆抗體對M y oⅩ蛋白結(jié)合特異性分析

2．4 兔抗M y oⅩ多克隆抗體有效識別多種組織中表達(dá)的M y oⅩ

分別將鼠腦、大腦、小腦、心、肝、肺、腎、皮膚組織作為電泳樣本，利用獲得的抗體進(jìn)行W e s t e r n b l o t分析．如圖3 A所示，兔抗M y oⅩ多克隆抗體可以識別鼠腦組織（包括大腦和小腦）中相對分子質(zhì)量分別為240000和165000的兩種形式的M y oⅩ，證實(shí)了神經(jīng)系統(tǒng)中兩種形式M y oⅩ的存在．在鼠心、肝、肺、腎和皮膚組織中，檢測到M y oⅩ不同水平的表達(dá)（見圖3 B）．另外，該多克隆抗體還可以識別結(jié)腸癌細(xì)胞SW 480和SW 620中的M y oⅩ（見圖3 C），說明該抗體具有廣泛的組織識別能力．

圖3 兔抗M y oⅩ多克隆抗體對鼠多種組織的免疫印記分析

2．5 兔抗M y oⅩ多克隆抗體的免疫熒光分析

用該多克隆抗體分別對C O S－7細(xì)胞、N L T細(xì)胞和神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光染色，如圖4所示，可以清晰地看到在C O S－7細(xì)胞、N L T細(xì)胞和神經(jīng)元中M y oⅩ的分布．在C O S－7和N L T細(xì)胞中，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞突起末端積累的特征；在培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中在軸突、樹突和胞體都有著色，細(xì)胞核周圍強(qiáng)染色的部位為M y oⅩ合成后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積累．

圖4 兔抗M y oⅩ多克隆抗體分別在C O S－7細(xì)胞、N L T細(xì)胞和神經(jīng)元中的免疫熒光分析

3 討論

M y oⅩ是一種只在脊椎動物中表達(dá)的非傳統(tǒng)的肌球蛋白，可作為動力蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本生命活動．M y oⅩ在肌肉、腎臟、肺、胸腺等組織均有不同程度的表達(dá)，在一些癌細(xì)胞中也有上調(diào)的趨勢．全長形式的M y oⅩ是細(xì)胞內(nèi)重要的分子馬達(dá)，與絲狀偽足的形成和延伸相關(guān)［13－14］．在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中M y oⅩ在板狀偽足的邊緣、膜皺邊和絲足頂端定位［15］．M y oⅩ的頭部動力區(qū)對于絲足的形成非常重要．絲足是細(xì)胞遷移前端的突起，絲足的增多和延長是細(xì)胞定向遷移能力增強(qiáng)的表現(xiàn)［16］．微管、微絲細(xì)胞骨架系統(tǒng)與細(xì)胞遷移息息相關(guān)，而M y oⅩ與微絲、微管均有相互作用，這表明了M y oⅩ與細(xì)胞遷移存在聯(lián)系．由E L I S A的結(jié)果顯示，本研究制備的多克隆抗體能夠與合成的半抗原發(fā)生抗原抗體的特異性反應(yīng)，證明了此抗體的特異性．進(jìn)一步的抗原吸附實(shí)驗(yàn)也證明了此多克隆抗體的特異性．這種多克隆抗體為M y oⅩ在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用研究提供了有利的條件．

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是腦組織中，M y oⅩ的表達(dá)是非常穩(wěn)定而且豐富的．值得注意的是，無頭形式的M y oⅩ存在于腦組織中，并且呈現(xiàn)出與全長形式的M y oⅩ不同的表達(dá)模式．這說明無頭形式的M y oⅩ只在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮作用，只是具體作用機(jī)制尚不清楚．本研究制備的M y oⅩ多克隆抗體為研究M y oⅩ在腦發(fā)育過程中的作用奠定了基礎(chǔ)．

［1］ S OU S A A D，CHE N E Y R E．M y o s i n－Ⅹ：a m o l e c u l a r m o t o r a t t h e c e l l's f i n g e r t i p s［J］．T r e n d s C e l l B i o l，2005，15（10）：533－539．

［2］ C I RU L L I V，Y E B RA M．N e t r i n s：b e y o n d t h e b r a i n［J］．N a t R e v M o l C e l l B i o l，2007，8（4）：296－306．

［3］ J I NG N H，S HE NG N Y，X I E Z H．T h e f u n c t i o n o f BMP s i g n a l i n g p a t h w a y d u r i n g t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m d e v e l o p m e n t［J］．C h i n J C e l l B i o l，2009，31（1）：2－8．

［4］ P I X C，R E N R Q，K E L L E Y R，e t a l．S e q u e n t i a l r o l e s f o r m y o s i n－X i n BMP 6－d e p e n d e n t f i l o p o d i a l e x t e n s i o n，m i g r a t i o n，a n d a c t i v a t i o n o f BMP r e c e p t o r s［J］．J C e l l B i o l，2007，179（3）：1569－1582．

［5］ D AN E N E H．I n t e g r i n p r o t e o m e s r e v e a l a n e w g u i d e f o r c e l l m o t i l i t y［J］．S c i S i g n a l，2009，89（2）：58．

［6］ AV RAAM I D E S C J，GA RMY S B，VA RN E R J A．I n t e g r i n s i n a n g i o g e n e s i s a n d l y m p h a n g i o g e n e s i s［J］．N a t R e v C a n c e r，2008，8（8）：604－617．

［7］ Z HU X J，WANG C Z，D A I P G，e t a l．M y o s i nⅩr e g u l a t e s n e t r i n r e c e p t o r s a n d f u n c t i o n s i n a x o n a l p a t h－f i n d i n g［J］．N a t C e l l B i o l，2007，9（2）：184－192．

［8］ S OU S A A D，CHE N E Y R E．M y o s i n－X：a m o l e c u l a r m o t o r a t t h e c e l l's f i n g e r t i p s［J］．T r e n d s C e l l B i o l，2005，15（10）：533－539．

［9］ T OY O S H I MA F，N I S H I D A E．I n t e g r i n－m e d i a t e d a d h e s i o n o r i e n t s t h e s p i n d l e p a r a l l e l t o t h e s u b s t r a t u m i n a n E B 1－a n d m y o s i n X－d e p e n d e n t m a n n e r［J］．EMB O J，2007，26（6）：1487－1498．

［10］ Y ON E Z AWA S，K I MURA A，KO S H I B A S．M o u s e m y o s i nⅩ：m o l e c u l a r a r c h i t e c t u r e a n d t i s s u e e x p r e s s i o n a s r e v e a l e d b y n o r t h e r n b l o t a n d i n s i t u h y b r i d i z a t i o n a n a l y s e s［J］．B i o c h e m B i o p h y s R e s C o mm u n，2000，271（2）：526－533．

［11］ T OKUO H，I K E B E M．M y o s i n X t r a n s p o r t s M e n a／VA S P t o t h e t i p o f f i l o p o d i a［J］．B i o c h e m B i o p h y s R e s C o mm u n，2004，319（1）：214－220．

［12］ S OU S A A D，B E R G J S，R O B E R T S ON B W，e t a l．M y o X i n b r a i n：d e v e l o p m e n t a l r e g u l a t i o n，i d e n t i f i c a t i o n o f a h e a d l e s s i s o f o r m s a n d d y n a m i c s i n n e u r o n s［J］．J C e l l B i o l，2006，119（1）：184－194．

［13］ B OH I L A B，R O B E R T S ON B W，CHE N E Y R E．M y o s i n－Ⅹi s a m o l e c u l a r m o t o r t h a t f u n c t i o n s i n f i l o p d i a f o r m a t i o n［J］．P r o c N a t l A c a d S c i U S A，2006，103（33）：12411－12416．

［14］ T OKUO H，MA B U CH I K，I K E B E M．T h e m o t o r a c t i v i t y o f M y o s i n－Ⅹp r o m o t e s a c t i n f i b e r c o n v e r g e n c e a t t h e c e l l p e r i p h e r y t o i n i t i a t e f i l o p o d i a f o r m a t i o n［J］．J C e l l B i o l，2007，179（2）：229－238．

［15］ N I E S，K E E Y，B R ONN E R F M．M y o s i n－Ⅹi s c r i t i c a l f o r m i g r a t o r y a b i l i t y o f X e n o p u s c r a n i a l n e u r a l c r e s t c e l l s［J］．D e v B i o l，2009，335（1）：132－142．

［16］ K E R B E R M L．A n o v e l f o r m o f m o t i l i t y i n f i l o p o d i a r e v e a l e d b y i m a g i n g M y o s i n－Ⅹa t t h e m i n g l e－m o l e c u l e l e v e l［J］．C u r r B i o l，2009，19（11）：967－973．

（責(zé)任編輯：方 林）

T h e p r e p a r a t i o n a n d p r e l i m i n a r y a p p l i c a t i o n o f r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t M y o s i nⅩ

Z HANG J i a n－h(huán) u a，S H I H e n g－l i a n g，Z HA I Y a n－h(huán) u a，YU H u a－l i，C AO R a n g－j u a n，Z HU X i a o－j u a n
（S c h o o l o f L i f e S c i e n c e s，N o r t h e a s t N o r m a l U n i v e r s i t y，C h a n g c h u n 130024，C h i n a）

T o o b t a i n t h e r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t M y o s i nⅩ，ap o l y p e p t i d e c o n t a i n i n g o f 1000～1021a m i n o a c i d s f r o m N－t e r m i n a l o f M y o s i nⅩw a s s y n t h e s i z e d a n d c o u p l e d t o K LH．T h e n，t h e p o l y p e p t i d e w a s u s e d t o i mm u n i z e N e w Z e a l a n d w h i t e r a b b i t s b y s u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n t o p r e p a r e t h e a n t i s e r u m．T h e t i t e r o f t h e a n t i s e r u m r e a c h e d t o 1∶51200a f t e r 4t i m e s o f i mm u n e a s r e v e a l e d b y E L I S A，a n d t h e s p e c i f i c i t y o f t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s c o n f i r m e d b y a n t i g e n a b s o r p t i o n t e s t．F u r t h e r m o r e，f o u n d t h i s p o l y c l o n a l a n t i b o d y c a n s p e c i f i c a l l y r e c o g n i z e d M y oⅩi n s e v e r a l t i s s u e s a s r e v e a l e d b y W e s t e r n b l o t．I n a d d i t i o n，i mm u n o f l u o r e s c e n c e d i s p l a y e d t h e d i s t r i b u t i o n o f M y o s i nⅩi n C O S－7c e l l s，N L T c e l l s a n d p r i m a r i l y c u l t u r e d n e u r o n s．I n c o n c l u s i o n，t h e M y o s i nⅩp o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s s u c c e s s f u l l y p r e p a r e d，w h i c h p r o v i d e d a p o w e r f u l t o o l f o r f u r t h e r s t u d y o f e x p r e s s i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f M y o s i nⅩi n t i s s u e s a n d c e l l s．

M y o s i nⅩ；p o l y c l o n a l a n t i b o d y；h a p t e n

R 392．1［學(xué)科代碼］180·2150

A

1000－1832（2012）01－0140－05

肌球蛋白是一種馬達(dá)蛋白，以肌動蛋白絲作為運(yùn)行的軌道，通過AT P的水解導(dǎo)致構(gòu)型的變化從而在肌動蛋白絲上移動，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的改構(gòu)和細(xì)胞運(yùn)動．目前鑒定的肌球蛋白家庭成員有20余種，其中肌球蛋白Ⅹ（m y o s i nⅩ，M y oⅩ）是僅表達(dá)于脊椎動物中的一種肌球蛋白，相對分子質(zhì)量為240000．M y oⅩ含有與肌動蛋白及AT P結(jié)合的頭部動力區(qū)；其頸部的I Q區(qū)域可與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，螺旋結(jié)構(gòu)域參與形成二聚體；其尾部區(qū)域包括了一個P E S T蛋白水解位點(diǎn)，3個連續(xù)的P H結(jié)構(gòu)域（p l e c k s t r i n h o m o l o g y d o m a i n），M y TH 4結(jié)構(gòu)域（m y o s i n－t a i l h o m o l o g y 4d o m a i n）和F E RM結(jié)構(gòu)域（b a n d－4．1／e z r i n／r a d i x i n／m o e s i n）［1］．M y oⅩ的尾部結(jié)構(gòu)域能與許多功能蛋白結(jié)合，目前已經(jīng)報道的有N e t r i n－1受體D C C［2］、BMP受體A L K 6［3－4］、I n t e g r i n［5－7］及微管等．已有的實(shí)驗(yàn)證明：M y oⅩ定位在細(xì)胞的板狀偽足、膜褶皺和絲足頂端，通過與肌動蛋白的結(jié)合及M e n a／VA S P的運(yùn)輸參與絲足的形成與延伸過程［8］．一系列的酵母雙雜交、體外相互作用和哺乳動物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，M y oⅩ通過F E RM結(jié)構(gòu)域與D C C及N e o g e n i n的胞內(nèi)段P 3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而在N e t r i n－1－D C C介導(dǎo)的神經(jīng)軸突導(dǎo)向和突起生長過程中發(fā)揮作用［9］．最近的研究表明，在動物大腦發(fā)育過程中還有另一種相對分子質(zhì)量為165000左右的無頭形式的M y oⅩ［10－11］，同全長的M y oⅩ相比，這種無頭形式的M y oⅩ缺少頭部動力區(qū)，因此不具備分子馬達(dá)的功能［12］．但是這兩種形式的M y oⅩ是如何被轉(zhuǎn)錄調(diào)控的，目前尚不清楚．

半抗原又稱不完全抗原，是指具有抗原性而無免疫原性的物質(zhì)．半抗原能與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生抗原－抗體反應(yīng)，但是半抗原本身相對分子質(zhì)量過小，無法刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)．用化學(xué)方法把半抗原與具有免疫原性的大分子蛋白－載體相結(jié)合以后，半抗原就構(gòu)成了載體的一個新的表位，這種半抗原－載體復(fù)合物便能刺激免疫反應(yīng)發(fā)生．

M y oⅩ的相對分子質(zhì)量比較大，抗原表位比較復(fù)雜，為了研究M y oⅩ分子在腫瘤發(fā)生和神經(jīng)發(fā)育中的作用，本文利用P l o t o f P r o t e i n H y d r o p a t h i c P r o f i l e軟件對M y oⅩ序列進(jìn)行了分析，選取了N端的21個氨基酸，以此多肽為免疫原制備了兔抗M y oⅩ多克隆抗體，并對其進(jìn)行了鑒定和初步應(yīng)用，為研究M y oⅩ在組織及細(xì)胞中的表達(dá)和分布提供了有效的手段．

2011－05－25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30871302；301170142）；吉林省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（200805130）．

張建華（1986—），女，碩士研究生；通訊作者：朱筱娟（1966—），女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)發(fā)育研究．