王萌 洪璇 孫欽文 李瑞林 楊朝陽(yáng) 陳公琰

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在許多國(guó)家均居惡性腫瘤之首。目前，化療仍是晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的主要治療手段，長(zhǎng)春瑞濱（Vinorelbine，諾維本，NVB）是治療NSCLC最有效的藥物之一，而多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）現(xiàn)象是其化療失敗的重要因素之一。迄今為止，在肺腺癌中關(guān)于NVB誘導(dǎo)的耐藥機(jī)制尚未見(jiàn)過(guò)報(bào)道，本研究的前期研究結(jié)果[1-3]表明，Bcl-2和MRP3在Anip973/NVB細(xì)胞系中的表達(dá)上調(diào)，且Bcl-2在肝癌、骨肉瘤，小細(xì)胞肺癌的耐藥機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。MRP家族中與肺癌耐藥有關(guān)的主要是MRP1、MRP3，在NSCLC細(xì)胞系中MRP3的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞對(duì)ADR、VCR、VP-16及DDP等化療藥物的耐藥呈正相關(guān)[4]。

基于以上研究，本研究應(yīng)用前期建立的Anip973/NVB的耐藥細(xì)胞系（已申請(qǐng)專利），建立裸鼠移植瘤模型，通過(guò)檢測(cè)Bcl-2和MRP3蛋白的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步研究人肺腺癌Anip973/NVB細(xì)胞系的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 NVB（法國(guó)皮爾法伯藥物研制公司）；優(yōu)級(jí)胎牛血清（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）；RPMI-1640培養(yǎng)液（黑龍江省腫瘤研究所自行配制）；胰酶（黑龍江省腫瘤研究所自行配制）；兔抗人Bcl-2（N-19）多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司），工作濃度為1:200；兔抗人MRP3單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），工作濃度為1:300；PV-6001（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞株與動(dòng)物 人肺腺癌細(xì)胞株Anip973由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤研究所惠贈(zèng)。人肺腺癌耐藥細(xì)胞株Anip973/NVB由作者前期誘導(dǎo)建立[5]。

裸鼠（品系nu/nu），雌性，17 g-21 g，4周-6周齡，30只，北京動(dòng)物研究所繁育，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2007-0001。所用墊料、飲水、標(biāo)準(zhǔn)飼料及其它與動(dòng)物接觸的物品均經(jīng)高壓滅菌處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 ①皮下移植瘤模型的建立：采用培養(yǎng)細(xì)胞皮下接種移植法，用1 mL注射器將人肺腺癌細(xì)胞Anip973和耐藥細(xì)胞Anip973/NVB以1×107個(gè)/只接種1次至裸鼠左腋?jìng)?cè)皮下，待瘤體長(zhǎng)徑長(zhǎng)至約10 mm時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)；②動(dòng)物：人肺腺癌細(xì)胞Anip973成瘤的裸鼠取12只完全隨機(jī)化分為Anip973治療組、Anip973對(duì)照組；人肺腺癌耐藥細(xì)胞Anip973/NVB成瘤的裸鼠取12只完全隨機(jī)化分為Anip973/NVB治療組、Anip973/NVB對(duì)照組。每組6只，治療組NVB注射劑量按20 mg/kg、0.2 mL生理鹽水稀釋，尾靜脈注射，對(duì)照組注射0.2 mL生理鹽水。治療7 d后處死裸鼠，取下皮下腫瘤，稱瘤質(zhì)量。

1.4 觀察指標(biāo) ①觀察治療前后瘤體的大?。阂泽w積（mm3）=0.5×長(zhǎng)徑（mm）×短徑（mm）2計(jì)算腫瘤體積，每天測(cè)量1次，繪制生長(zhǎng)曲線；②計(jì)算抑瘤率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤重量/對(duì)照組平均腫瘤重量）×100%，局部實(shí)體瘤生長(zhǎng)體積的測(cè)定：注射前用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑（a）和最短徑（b），并稱體重。腫瘤體積（V）=1/6пab2（п表示圓周率）；③形態(tài)學(xué)觀察：取1 mm×1 mm×1 mm的新鮮腫瘤組織，用2%戊二醛固定，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片機(jī)制片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察；④Bcl-2和MRP3蛋白的表達(dá)：方法：標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片作免疫組織化學(xué)染色（SP法）；一抗分別為：Bcl-2、MRP3；結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：Bcl-2胞漿著色為陽(yáng)性，MRP3胞漿和（或）胞膜著色為陽(yáng)性，按陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤的比例，將＜25%為陰性，≥25%且＜50%為陽(yáng)性，≥50%為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，組間比較用析因設(shè)計(jì)的方差分析法，兩兩比較結(jié)果用Bonferroni法，兩者相關(guān)性用Pearson相關(guān)系數(shù)（r）分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠生長(zhǎng)及成瘤情況 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中裸鼠飲水、進(jìn)食正常，無(wú)腹瀉、活動(dòng)遲緩等不良反應(yīng)，無(wú)一荷瘤裸鼠自然死亡（圖1）。Anip973細(xì)胞移植瘤成瘤率為93.3%（14/15），Anip973/NVB細(xì)胞移植瘤成瘤率為86.7%（13/15）。裸鼠在接種后平均6 d成瘤，接種10 d后腫瘤直徑約10 mm。

2.2 移植瘤的生長(zhǎng)情況的比較 經(jīng)NVB治療后，Anip973治療組移植瘤生長(zhǎng)減緩甚至出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，Anip973對(duì)照組、Anip973/NVB治療組、Anip973/NVB對(duì)照組移植瘤生長(zhǎng)曲線相同（圖2）；Anip973治療組經(jīng)NVB治療的抑瘤率為60.0%，與Anip973對(duì)照組比較腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑（P＜0.001）。Anip973/NVB治療組的抑瘤率為4.65%，腫瘤生長(zhǎng)與Anip973/NVB對(duì)照組比較無(wú)明顯差異（P=0.358）（表1）。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 透射電鏡下Anip973細(xì)胞移植瘤經(jīng)NVB治療后細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)。細(xì)胞體積縮小，微絨毛結(jié)構(gòu)消失，胞膜完整，可見(jiàn)部分細(xì)胞核仁消失。部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)還可見(jiàn)高密度團(tuán)塊物質(zhì)以及凝聚細(xì)胞器的堆積（圖3A）。高倍下細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿大量的游離核蛋白體，線粒體少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈小桿狀或囊泡狀，還可見(jiàn)大的胞內(nèi)微腺腔結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞周圍還可見(jiàn)吞噬細(xì)胞的碎片，已形成由質(zhì)膜包裹內(nèi)含完整的細(xì)胞器和核碎片等細(xì)胞內(nèi)容物的凋亡小體（圖3B）。Anip973/NVB細(xì)胞移植瘤經(jīng)NVB治療后細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面有大量的微絨毛結(jié)構(gòu)，核仁明顯較多，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)（圖3C）。高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)，線粒體較小，還可見(jiàn)到微腺管結(jié)構(gòu)（圖3D）。

2.4 Bcl-2蛋白和MRP3蛋白的表達(dá) Bcl-2在Anip973/NVB治療組、Anip973/NVB對(duì)照組移植瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為74%、72%，明顯高于在Anip973治療組、Anip973對(duì)照組中的47%、48%（P＜0.001）。MRP3在Anip973/NVB治療組、Anip973/NVB對(duì)照組移植瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為79%、76%，也明顯高于在Anip973治療組、Anip973對(duì)照組移植瘤中的53%、52%（P＜0.001）（表2）。Bcl-2和MRP3的表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r=0.106, P=0.091）（圖4）。

3 討論

腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥是導(dǎo)致腫瘤化學(xué)治療失敗的重要原因之一，也是困擾腫瘤治療的關(guān)鍵性難題。NVB作為重要的抗癌藥物，廣泛應(yīng)用于NSCLC、晚期乳腺癌、霍奇金病、小細(xì)胞肺癌等。研究[5]表明，多數(shù)細(xì)胞毒制劑通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)殺傷細(xì)胞治療腫瘤。Bcl-2家族是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，肺癌細(xì)胞耐藥與凋亡途徑中Bcl-2過(guò)度表達(dá)相關(guān)[6]。 此外，Bcl-2在許多腫瘤中與化療藥物耐藥密切相關(guān)[7]。在急性髓細(xì)胞樣白血病中，Bcl-2與化療藥物耐藥相關(guān)，并且針對(duì)Bcl-2 mRNA的反義寡核苷酸增加了AML細(xì)胞對(duì)表阿霉素的敏感性[8]。在胰腺癌細(xì)胞中Bcl-2過(guò)表達(dá)并通過(guò)ERK/Bcl-2通路抵抗化療藥物誘導(dǎo)的凋亡[9]。MRP屬于三磷酸腺苷依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其作用機(jī)制是通過(guò)直接將細(xì)胞毒藥物排出和/或?qū)⑺幬锓蛛x成胞內(nèi)的小隔離體，使藥物不能與靶位點(diǎn)結(jié)合，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。有報(bào)道在小細(xì)胞肺癌中，兩者的聯(lián)合表達(dá)與耐藥密切相關(guān)[3]。在肺癌細(xì)胞中，MRP3 mRNA表達(dá)水平與阿霉素、長(zhǎng)春新堿、依托泊苷、順鉑耐藥密切相關(guān)[10,11]。此外， 在胰腺癌細(xì)胞中MRP3與氟尿嘧啶耐藥密切相關(guān)；在肝癌細(xì)胞中，MRP3與阿霉素耐藥密切相關(guān)[12,13]。

圖1 治療中的裸鼠。箭頭示瘤體。Fig 1 Nude mice in the treatment. Arrow shows the tumor.

圖2 Anip973和Anip973/NVB細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線。NVB治療后，Anip973治療組細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)緩慢并且抑制了移植瘤的生長(zhǎng)（P＜0.001）。然而，Anip973/NVB移植瘤經(jīng)NVB治療后，生長(zhǎng)情況與兩個(gè)對(duì)照組相似（P=0.358）。Fig 2 Tumor growth curves of Anip973 cell and Anip973/NVB cell xenografts. After treated by vinorelbine, Anip973 xenografts grew slowly and vinorelbine inhibited the growth of Anip973 xenografts(P＜0.001). However, growth of Anip973/NVB xenografts treated by vinorelbine was similar with the two untreated groups (P=0.358).

圖3 NVB治療后Anip973和Anip973/NVB細(xì)胞透射電鏡圖（×10,000）。A：透射電鏡下Anip973移植瘤細(xì)胞經(jīng)NVB治療后細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)。細(xì)胞體積縮小，微絨毛結(jié)構(gòu)消失，可見(jiàn)部分細(xì)胞核仁消失；B：Anip973移植瘤細(xì)胞經(jīng)NVB治療后染色質(zhì)凝聚并形成凋亡小體；C：Anip973/NVB細(xì)胞移植瘤經(jīng)NVB治療后，表面有大量的微絨毛結(jié)構(gòu)，核仁明顯較多，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)；D：Anip973/NVB細(xì)胞移植瘤經(jīng)NVB治療后高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)，線粒體較小，還可見(jiàn)到微腺管結(jié)構(gòu)。Fig 3 Morphological changes in apoptosis observed in Anip973 and Anip973/NVB xenografts after treatment with vinorelbine by TEM (×10,000).A: Anip973 cells after treatment with vinorelbine presented apoptotic characteristics, such as cell shrinkage, loss of microvilli and nucleolus ; B:Anip973 cells after treatment with vinorelbine presented chromatin condensation and formation of apoptotic bodies ; C: Anip973/NVB xenografts after treatment with vinorelbine, the surface has a lot of microvilli structure, nucleuos increased clearly, there were rich cytoplasmic in the cytoplasm; D: Anip973/NVB xenografts after treatment with vinorelbine, presented developed golgi complexes, mitochondria was small，and micro-tublar structure can be seen.

表1 各組瘤重及抑瘤率的比較Tab 1 Comparison of tumor weight and inhibition rate among groups

表2 Bcl-2和MRP3蛋白在Anip973和Anip973/NVB細(xì)胞裸鼠移植瘤中的表達(dá)Tab 2 The expression of Bcl-2 and MRP3 in Anip973 and Anip973/NVB xenografts

圖4 免疫組化法檢測(cè)Bcl-2（A，B）和MRP3（C，D）蛋白在Anip973和Anip973/NVB細(xì)胞裸鼠移植瘤中的表達(dá)（x400）。Bcl-2蛋白的表達(dá)在Anip973/NVB治療組（B）高于Anip973治療組（A）。MRP3蛋白的表達(dá)在 Anip973/NVB治療組（D）高于 Anip973治療組（C）。Fig 4 The expressions of Bcl-2 (A, B) and MRP3 (C, D) in Anip973 and Anip973/NVB xenografts by immunohistochemistry (x400). The expression of Bcl-2 in Anip973/NVB treatment group (B) was higher than that in the Anip973 treatment group (A)，and the expression of MRP3 in the Anip973/NVB treatment group (D) was higher than that in the Anip973 treatment group (C).

Anip973/NVB細(xì)胞系對(duì)多種藥物有不同程度的耐藥性，細(xì)胞耐藥性狀穩(wěn)定，是可靠的人肺腺癌MDR細(xì)胞模型[14,15]。本實(shí)驗(yàn)采用該細(xì)胞系建立裸鼠移植瘤模型，成瘤率達(dá)到86.7%（13/15）。繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，Anip973細(xì)胞移植瘤經(jīng)NVB治療后生長(zhǎng)明顯減緩甚至縮小，其它三組移植瘤生長(zhǎng)無(wú)明顯差異，生長(zhǎng)曲線接近；稱瘤質(zhì)量，計(jì)算出Anip973細(xì)胞移植瘤經(jīng)NVB治療的抑瘤率為60%，生長(zhǎng)明顯受抑，Anip973/NVB細(xì)胞移植瘤的抑瘤率為4.65%，生長(zhǎng)沒(méi)有受到抑制；電鏡下，經(jīng)NVB治療后Anip973細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的特征性形態(tài)改變，而Anip973/NVB耐藥細(xì)胞未出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)，NVB對(duì)其無(wú)抑制作用。以上結(jié)果表明Anip973/NVB耐藥細(xì)胞移植瘤已對(duì)NVB耐藥。文獻(xiàn)[16]報(bào)道，MRP與多種腫瘤細(xì)胞耐藥密切相關(guān)。亦有研究[10]發(fā)現(xiàn)MRP的過(guò)度表達(dá)增強(qiáng)了ATP依賴的GS-X泵的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而增加GSH-S偶合物對(duì)細(xì)胞毒藥物的外排，此外MRP還能通過(guò)改變胞內(nèi)藥物分布產(chǎn)生耐藥；Bcl-2是凋亡抑制原癌基因，其編碼蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡作用，并能延長(zhǎng)細(xì)胞生存期，已證實(shí)其在肺癌患者的耐藥性中起著重要的作用[11,12]。本實(shí)驗(yàn)中，免疫組化結(jié)果顯示MRP3及Bcl-2在Anip973/NVB耐藥細(xì)胞移植瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于在Anip973細(xì)胞移植瘤中的表達(dá)。我們分析可能是由于MRP3通過(guò)上述機(jī)制致使Anip973/NVB耐藥細(xì)胞內(nèi)化療藥物蓄積減少，從而降低了藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。我們的研究結(jié)果提示，MRP3基因可能參與了Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系的多藥耐藥；Bcl-2基因可能通過(guò)抑制了長(zhǎng)春瑞濱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而延長(zhǎng)了Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的存活期，這可能也是該細(xì)胞系產(chǎn)生耐藥的機(jī)制之一。此外，經(jīng)一次NVB治療后，MRP3及Bcl-2蛋白在Anip973細(xì)胞及Anip973/NVB耐藥細(xì)胞移植瘤中的表達(dá)與各自對(duì)照組比較無(wú)明顯差別，提示一次治療可能沒(méi)有引起Anip973細(xì)胞對(duì)NVB耐藥，且Anip973/NVB耐藥細(xì)胞經(jīng)NVB治療后沒(méi)有對(duì)MRP3及Bcl-2蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。本研究未發(fā)現(xiàn)MRP3及Bcl-2蛋白表達(dá)在Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系中的相關(guān)性。

多藥耐藥是一個(gè)十分復(fù)雜的生物過(guò)程，影響因素及參與機(jī)制眾多，一種化療藥物耐藥可能涉及多種耐藥基因、蛋白表達(dá)的改變。Anip973/NVB細(xì)胞系動(dòng)物模型的建立對(duì)今后研究NSCLC對(duì)NVB的多藥耐藥機(jī)制具有較大的實(shí)用價(jià)值，我們以后也可以通過(guò)此方法檢測(cè)其它腫瘤相關(guān)因子來(lái)研究該細(xì)胞系的多藥耐藥機(jī)制。