燕翔 趙曉 焦順昌 孫勝杰 吳亮亮 吳志勇

肺癌的發(fā)病率高，預(yù)后差。晚期肺癌的治療目前以化療為主，但化療的5年生存率不高，分子靶向治療對(duì)生存率的提高也有限。肺癌患者的免疫狀態(tài)與患者的腫瘤臨床病理學(xué)特征以及與預(yù)后的關(guān)系成為近年來腫瘤研究焦點(diǎn)之一。在腫瘤細(xì)胞免疫中，T細(xì)胞起中心調(diào)控作用。T細(xì)胞分為CD4+、CD8+T細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞表面分子又分為幾大亞類，在維持機(jī)體免疫平衡中均起著各自的作用。其中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群（Treg）具有抑制其它T細(xì)胞活化的功能[1]，并與腫瘤免疫逃逸有密切關(guān)系[2]，其數(shù)量與患者腫瘤進(jìn)展程度和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。去除Treg或封閉其抑制功能可使腫瘤免疫恢復(fù)[3]。CD8+CD28-T細(xì)胞存在于腫瘤組織中，具有抑制T、B細(xì)胞活性和介導(dǎo)細(xì)胞毒活性兩大功能。

多西他賽和培美曲塞與順鉑的聯(lián)合方案為目前肺腺癌化療最常見的一線方案。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中多西他賽已被證實(shí)可選擇性抑制Treg細(xì)胞[4]。培美曲塞是一種多靶點(diǎn)抗葉酸代謝細(xì)胞毒藥物，對(duì)機(jī)體免疫功能的影響未明。本研究收集64例晚期肺腺癌患者化療前后外周靜脈血，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其外周血中T淋巴細(xì)胞亞群占總淋巴細(xì)胞比例，與正常對(duì)照組相比較。并比較多西他賽聯(lián)合順鉑與培美曲塞聯(lián)合順鉑化療對(duì)肺腺癌患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的影響，以探討化療藥物影響機(jī)體腫瘤免疫功能的機(jī)制及其可能的影響因素。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究收集解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2010年1月-2011年7月晚期肺腺癌患者，共64例。入選患者均為經(jīng)病理確診的肺腺癌。根據(jù)AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)（第7版），均為IIIb期-IV期患者。入選前1個(gè)月內(nèi)未做過其它抗腫瘤治療，近3個(gè)月內(nèi)未用過免疫增強(qiáng)劑，Karnofsky評(píng)分＞70分，預(yù)計(jì)生存期＞3個(gè)月。經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行，每位入組患者簽署知情同意書，隨機(jī)進(jìn)入多西他賽和培美曲塞治療組。分別在治療前、化療第4天、化療第7-10天（圖表中為簡(jiǎn)便起見，以第10天代表）及第1周期化療結(jié)束后1周內(nèi)（第21天前后）對(duì)患者采取外周血，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。15例患者因第10天或第21天數(shù)據(jù)缺失，按失訪處理。最后得到并分析49例患者完整數(shù)據(jù)，年齡24歲-70歲，中位年齡51歲。其中男27例，女22例。對(duì)照組33例均為本院體檢的健康者，年齡26歲-75歲，中位年齡46歲。其中男15例，女18例。

1.2 檢測(cè)方法 用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)被檢者外周血淋巴細(xì)胞表面分子CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD4+CD25+。整個(gè)操作由專人負(fù)責(zé)；流式抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司，儀器為美國(guó)BD公司的FASCalibur流式細(xì)胞儀。

T細(xì)胞亞群操作步驟為：取5 mL全血與適當(dāng)體積的相應(yīng)抗體及同型對(duì)照抗體混勻室溫避光孵育20 min，加入2 mL流式細(xì)胞專用紅細(xì)胞裂解液，避光5 min-10 min，1,500 rpm離心5 min，棄上清，洗滌2次，加PBS 0.5 mL混勻上機(jī)，在直方圖中框出淋巴細(xì)胞群，再分別計(jì)數(shù)10,000個(gè)淋巴細(xì)胞，標(biāo)記出細(xì)胞百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 本研究所涉及數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在T細(xì)胞亞群比例比較時(shí)，肺癌組及對(duì)照組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析（方差不齊時(shí)，采用t’檢驗(yàn)），不同時(shí)間點(diǎn)之間采用重復(fù)測(cè)量的方差分析（若Mauchly's Test of Sphericity P＜0.05，則以Greenhouse-Geisser法校正），進(jìn)一步多重比較采用LSD法。結(jié)果以Mean±SD表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者組與健康組T細(xì)胞亞群的比較 肺癌患者組與健康組在性別、年齡分布無明顯差異（P＞0.05）。表1所示，49例肺癌患者CD3+、CD3+CD4+細(xì)胞比例明顯低于健康組，比例分別為67.1±11.4 vs 72.0±6.0（P＜0.05），38.1±9.6 vs 42.0±6.4（P＜0.05）。CD4+CD25+（Treg）細(xì)胞比例明顯高于健康組，比例為10.8±3.9 vs 8.4±3.5（P＜0.01）。CD4+/CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD28-與健康組相比無明顯差異。數(shù)據(jù)提示，肺癌患者的CD3+、CD3+CD4+、CD4+CD25+等T細(xì)胞的數(shù)量較健康對(duì)照組存在明顯差異，而這些亞群細(xì)胞的數(shù)量和功能缺陷與肺癌患者的免疫功能狀態(tài)有關(guān)（表1）。

2.2 肺癌患者化療前后不同時(shí)間點(diǎn)T細(xì)胞亞群的變化 與化療前比較，49例晚期肺腺癌患者化療后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)CD3+細(xì)胞均升高，差異有明顯差異。第4天CD3+CD4+細(xì)胞比例及CD4+/CD8+升高，CD8+CD28-降低，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第7-10天CD3+CD4+細(xì)胞比例明顯升高。第21天患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例與化療前基本相同，提示化療后短期內(nèi)患者免疫功能有所提高（表2，圖1）。

2.3 多西他賽組與培美曲塞組化療前后T淋巴細(xì)胞的變化 將多西他賽+順鉑組與培美曲塞+順鉑組進(jìn)行分層分析。多西他賽組共納入23例患者，培美曲塞組共納入26例患者。兩組在性別、年齡方面比較無明顯差異。同樣將兩組患者化療后第4、7-10及21天的外周血T淋巴細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：多西他賽化療后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CD3+均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其它細(xì)胞亞群在化療后未出現(xiàn)明顯變化。而培美曲塞組化療第4天CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+升高，CD3+CD8+及CD8+CD28-比例降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；熀蟮?-10天CD3+、CD3+CD4+及CD4+/CD8+仍明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2，圖3，表3）。

2.4 一線化療2周期后疾病進(jìn)展（progressive disease,PD）的患者與部分緩解（partial response, PR）患者T淋巴細(xì)胞亞群變化的統(tǒng)計(jì)分析 將檢測(cè)結(jié)果根據(jù)隨訪情況進(jìn)行分層分析。49例患者經(jīng)一線化療2周期后，5例患者PD，14例患者PR，其余患者穩(wěn)定（stable disease,SD）。將PD與PR患者化療后第4、7-10及21天的外周血T淋巴細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：兩組患者化療后第10天CD3+均升高；PR組患者化療后第4天及第7-10天CD3+CD4+細(xì)胞升高；化療后第4天CD3+CD8+、CD8+CD28-細(xì)胞降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

3 討論

機(jī)體免疫功能在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起著重要作用，近年來肺癌患者的免疫狀態(tài)與患者的腫瘤臨床病理學(xué)特征以及與預(yù)后的關(guān)系成為腫瘤研究焦點(diǎn)之一?；熓峭砥诜伟┑闹饕委熓侄巍Ｌ骄炕煂?duì)免疫功能的影響和免疫功能與腫瘤治療效果的關(guān)系，對(duì)于提高腫瘤綜合治療水平、加強(qiáng)對(duì)預(yù)后的認(rèn)識(shí)有著重要的臨床意義。

表1 肺癌組和對(duì)照組T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果（Mean±SD, %）Tab 1 The T lymphocyte subset of the lung cancer patient group and the control group (Mean±SD, %)

表2 化療前后T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果（Mean±SD, %）Tab 2 The T lymphocyte subset before and after chemotherapy (Mean±SD, %)

圖1 T細(xì)胞亞群化療前后比例變化趨勢(shì)圖Fig 1 The trend of T lymphocyte subset before and after CT(chemotherapy)

圖2 多西他賽組化療前后T淋巴細(xì)胞變化趨勢(shì)圖Fig 2 The trend of T lymphocyte subset in doxetaxol group

圖3 培美曲塞組化療前后T淋巴細(xì)胞變化趨勢(shì)圖Fig 3 The trend of T lymphocyte subset in pemetrexed group

多西他賽與培美曲塞聯(lián)合順鉑方案由于其安全性好、可耐受度高、療效肯定及住院時(shí)間短等原因，是目前臨床上晚期非小細(xì)胞肺癌尤其是肺腺癌一線治療中最常采用的方案。本研究采用前瞻性試驗(yàn)設(shè)計(jì)，入組患者隨機(jī)進(jìn)入兩種化療方案組，總結(jié)試驗(yàn)結(jié)果，分析這兩種化療方案對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，以期為化療與免疫治療的結(jié)合及提高臨床療效提供依據(jù)。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞，在腫瘤免疫中起中心調(diào)控作用。檢測(cè)患者T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平，可以輔助動(dòng)態(tài)分析抗腫瘤藥物治療過程中機(jī)體細(xì)胞免疫功能的變化。

首先使用流式細(xì)胞檢測(cè)法分析來自于49例晚期肺腺癌患者的外周血的CD3+、CD4+、CD8+和CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD4+CD25+T細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的比例，并與正常人進(jìn)行比較。CD3+CD4+T為輔助T淋巴細(xì)胞，CD3+CD8+T為抑制T淋巴細(xì)胞。正常情況下，CD3+CD8+和CD3+CD4+之間保持著動(dòng)態(tài)平衡，CD4+/CD8+下降表示患者處于免疫抑制狀態(tài)。 CD8+T細(xì)胞根據(jù)CD28的表達(dá)與否分為抑制性T細(xì)胞（Ts，人類表型為CD8+CD28-）和殺傷性T細(xì)胞（Tc，人類表型為CD8+CD28+）。CD8+CD28-T細(xì)胞存在于腫瘤組織中，是一群終末分化的細(xì)胞，被認(rèn)為具有抑制T、B細(xì)胞活性和介導(dǎo)細(xì)胞毒活性的功能[5]。CD4+CD25+T（Treg）細(xì)胞是一類具有負(fù)免疫調(diào)節(jié)作用的T淋巴細(xì)胞亞群。Treg細(xì)胞可以抑制識(shí)別自身腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞的發(fā)育和活化，在介導(dǎo)機(jī)體腫瘤免疫耐受中起重要作用[6]。近年來研究[7]表明，許多惡性腫瘤患者外周血和腫瘤局部微環(huán)境中的Treg細(xì)胞比例都明顯增高，且數(shù)量還與患者腫瘤進(jìn)展程度和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)?？刂芓reg的數(shù)量和功能有可能是腫瘤免疫治療的新策略[8]。

表3 不同化療藥物組T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果（Mean±SD, %）Tab 3 The T lymphocyte subset in groups of different chemotherapy drugs（Mean±SD, %）

表4 PD與PR患者T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果（Mean±SD, %）Tab 4 The T lymphocyte subset seperately in PD and PR group (Mean±SD, %)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：肺癌患者外周血CD3+、CD3+CD4+細(xì)胞比例明顯低于健康組，P＜0.05。CD4+CD25+（Treg）細(xì)胞比例明顯高于健康組，P＜0.01。CD4+/CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD28-與正常人相比無明顯差異。惡性腫瘤患者CD4+T細(xì)胞亞群的改變情況報(bào)道不一，但是多數(shù)研究顯示CD4+T細(xì)胞亞群在惡性腫瘤患者中是表現(xiàn)為減少的。Treg細(xì)胞在多種實(shí)體瘤組織及患者外周血中均高于正常對(duì)照。說明肺癌患者細(xì)胞免疫功能處于抑制狀態(tài)，符合腫瘤的免疫逃避機(jī)制。

近年的研究發(fā)現(xiàn)各種非遺傳因素（如化療藥物）導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞減少可誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)性增生，從而使體內(nèi)的T細(xì)胞數(shù)目保持在一定的水平。淋巴細(xì)胞自穩(wěn)性增生可使腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞克隆在“廣闊”的空間內(nèi)擴(kuò)增，增強(qiáng)抗腫瘤的免疫應(yīng)答[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺癌患者在化療后CD3+升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD3+CD4+細(xì)胞比例及CD4+/CD8+明顯升高，CD8+CD28-明顯降低，結(jié)果具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。后各細(xì)胞比例逐漸恢復(fù)，至第21天與化療前基本相同。提示化療不僅沒有削弱機(jī)體免疫功能，且能誘使機(jī)體朝正向免疫應(yīng)答發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)還分析了不同化療藥物對(duì)患者免疫功能影響的差別。已有許多報(bào)道[4,10-15]證實(shí)環(huán)磷酰胺、多西他賽、氟達(dá)拉濱等化療藥物及索拉非尼、抗CD25單抗類靶向藥物等對(duì)Treg起選擇性抑制作用。而其它化療藥物對(duì)Treg細(xì)胞的影響尚未十分明確。為觀察不同化療藥物對(duì)免疫功能的影響，本實(shí)驗(yàn)組患者隨機(jī)進(jìn)入多西他賽組及培美曲賽組，兩組患者均為IIIb期-IV期肺腺癌患者，性別、年齡等因素均無明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化療后短期內(nèi)兩組患者的效應(yīng)性T細(xì)胞CD3+CD4+均出現(xiàn)明顯升高，且培美曲塞組更為明顯，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，且伴有CD3+CD8+及CD8+CD28-等抑制性細(xì)胞成分的明顯減少。結(jié)果提示與多西他塞組比較，培美曲塞似乎對(duì)化療后短期內(nèi)免疫功能的改善有更明顯的作用。根據(jù)既往文獻(xiàn)提示，我們預(yù)測(cè)多西他賽組可能出現(xiàn)Treg細(xì)胞的特異性抑制。然而我們著重觀察了化療前后兩組患者的Treg細(xì)胞比例，并未觀察到明顯變化，甚至在化療后第4天Treg細(xì)胞數(shù)量還有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因，可能與化療合并使用小劑量糖皮質(zhì)激素進(jìn)行預(yù)處理有關(guān)。為了防止皮疹、水鈉潴留及過敏反應(yīng)等，臨床實(shí)際應(yīng)用培美曲塞及多西他賽時(shí)，需在化療前一天、化療當(dāng)天及化療后一天口服小劑量地塞米松。實(shí)驗(yàn)[14]表明，糖皮質(zhì)激素可明顯提升外周血Treg細(xì)胞數(shù)量。激素可能既可抑制效應(yīng)性T細(xì)胞，又可上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，也可能增強(qiáng)了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制功能?；熕幬镫m然可能選擇性地清除CD4+CD25+FoXP3+Treg細(xì)胞，但其作用不敵糖皮質(zhì)激素的影響。另外，化療藥物不同的給藥方式以及研究對(duì)象不同的病理類型、疾病分期對(duì)免疫功能產(chǎn)生的影響也不同。因此在本實(shí)驗(yàn)中，化療短期內(nèi)CD4+CD25+總數(shù)量表現(xiàn)為上升的結(jié)果。而化療7 d-10 d后，化療對(duì)機(jī)體的短期影響結(jié)束，Treg細(xì)胞含量可能升高。因此結(jié)合臨床實(shí)際，本研究在晚期肺腺癌聯(lián)合化療對(duì)Treg細(xì)胞的影響觀察中未復(fù)制出與文獻(xiàn)報(bào)道相似的結(jié)果。同樣，雖然文獻(xiàn)報(bào)道多西他賽在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可選擇性抑制Treg細(xì)胞，但將多西他賽與培美曲塞進(jìn)行分層分析，并未得出特異性結(jié)果。培美曲塞組在化療后第4天CD3+細(xì)胞比例升高更明顯，提示似乎培美曲塞對(duì)化療后短期內(nèi)免疫功能的改善有更明顯的作用。

本實(shí)驗(yàn)初步探討了T細(xì)胞亞群與近期療效的關(guān)系。結(jié)果顯示，PR組患者化療后第4天及第7-10天CD3+CD4+細(xì)胞升高，化療后第4天CD3+CD8+、CD8+CD28-細(xì)胞降低（P＜0.05）。其余細(xì)胞成分未觀察到明顯變化。似乎提示化療后體內(nèi)免疫環(huán)境有所改善。但病例數(shù)太少，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可能存在偏差。因此該結(jié)果是否提示化療后對(duì)體內(nèi)免疫格局的變化與預(yù)后有明確關(guān)系，尚需要更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

以上結(jié)果提示化療對(duì)機(jī)體免疫微環(huán)境具有一定的優(yōu)化作用，能活化抗腫瘤免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)。臨床實(shí)際應(yīng)用中可能影響患者免疫功能的原因很多，誘發(fā)抗腫瘤免疫活化的因素還不完全了解。而化療藥物對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞的作用機(jī)制以及化療藥物在第幾個(gè)周期后發(fā)揮明顯作用更是知之甚少。免疫治療在通往臨床應(yīng)用的途中，還有許多關(guān)鍵問題有待解決，包括合并化療藥的給藥方式、免疫治療的切入時(shí)機(jī)等。而糖皮質(zhì)激素在腫瘤患者體內(nèi)引起的免疫功能改變是否影響到腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及化療效果，也需要更多實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。