吳 斌，肇慧君，李 葉，胡曉利

（1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連 116001；2.江蘇洋河酒廠，江蘇宿遷 223725 ）

傳染性胰臟壞死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）是一種經(jīng)濟(jì)上非常重要的魚病原體，在幼大馬哈魚中能夠引起及其嚴(yán)重的感染，導(dǎo)致高的死亡率。最初只在北美及歐洲的一些國家流行，近年來隨著水生動(dòng)物進(jìn)口貿(mào)易的增加，傳染性胰臟壞死病已傳入我國并在一些地區(qū)流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

RT-PCR是針對(duì)RNA病毒的一種檢測(cè)方法，目前發(fā)展已非常成熟，證實(shí)是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏和方便的方法[1]。本文針對(duì)IPNV A片段VP5基因和VP3基因分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，同時(shí)優(yōu)化了反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。最終用優(yōu)化好的反應(yīng)條件對(duì)從人工感染的斑馬病魚中提取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出了224 bp和206 bp的目的條帶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與細(xì)胞 IPNV毒株、CHSE-214（大鱗大麻哈魚胚胎細(xì)胞系）、EPC（鯉魚上皮瘤細(xì)胞）、FHM（鯉魚上皮細(xì)胞）凍存細(xì)胞由本室保存提供。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清購自杭州四季青生物公司；M199購自GIBCO公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DEPC、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA片段純化試劑盒、PCR產(chǎn)物克隆用載體、DNA Marker均購自大連寶生物工程公司；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.1.3 引物序列 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)2對(duì)RT-PCR引物（表1）。并通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST驗(yàn)證引物序列特異性后，由大連寶生物工程有限公司合成。

表1 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)IPNV的兩對(duì)引物

1.2 方法

1.2.1 反轉(zhuǎn)錄條件優(yōu)化 在PCR管中加入RNA模板 5 μL、5 μL 的 5倍逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩沖液、2 μL dNTP、0.5 μL RNA酶抑制劑（20U）、1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶AMV（10IU），加 DEPC 水至 25 μL[2]。42 ℃ 60 min反應(yīng)，合成模板cDNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)化 用引物F1和R1時(shí)，本試驗(yàn)采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，而用引物F2和R2時(shí)，則采用一步法進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)dNTP、Mg2+和引物的濃度進(jìn)行優(yōu)化[3]，試劑配方分別為：

F1/R1：10×PCR Buffer 4.0 μL，dNTPs Mixture 3.0 μL，MgCl2（25mM） 2.5 μL，TaqPolymerase 0.5 μL，IPNV-F1（20 pmol/μL）1.5 μL，IPNV-R1（20 pmol/μL）1.5 μL，cDNA 5.0 μL，ddH2O 32.0 μL，總計(jì) 50.0 μL；

F2/R2：10×E×Buffer 5.0 μL，MgCl2（25mM）3.0 μL，dNTPs Mixture 4.0 μL，E×Taq E 0.5 μL，IPNV-F2（20 pmol/μL） 2.5 μL，IPNV-R2（20 pmol/μL） 2.5 μL，AMV（5 u/μL） 1.0 μL，RNaSin（40 u/μL）0.25 μL，RNA 5.0 μL，ddH2O 26.25 μL，總計(jì) 50 μL。1.2.3 RT-PCR特異性試驗(yàn) 采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，用IPNV的引物對(duì)IPNV、IHNV、SVCV、VHSV和ISA的RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，確定方法特異性。

1.2.4 RT-PCR的靈敏度試驗(yàn) 取200 μL病毒懸液，提取RNA[4]，然后對(duì)RNA進(jìn)行10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度進(jìn)行RT-PCR，以檢測(cè)方法的靈敏度。

2 結(jié)果與討論

2.1 RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 Mg2+濃度優(yōu)化

Mg2+濃度優(yōu)化的電泳圖見圖1，當(dāng)Mg2+的濃度為1.0～3.0 mM/L時(shí)，兩對(duì)引物所擴(kuò)增的條帶均很亮。使用F1/R1時(shí)，Mg2+終濃度為1.0 mM/L時(shí)，特征條帶最亮。使用F2/R2時(shí)，Mg2+終濃度為3.0 mM/L時(shí)，特征條帶最亮，形成的引物二聚體相對(duì)也少。因此，使用引物F1/R1和F2/R2擴(kuò)增目的片段時(shí)，Mg2+的最佳終濃度分別為1.0 mM/L和3.0 mM/L。

2.1.2 dNTP濃度優(yōu)化

dNTP濃度優(yōu)化的電泳圖見圖2，反應(yīng)體系中dNTP終濃度為1.0 mM/L～3.5 mM/L，兩對(duì)引物所擴(kuò)增的RT-PCR產(chǎn)物均形成較亮的特征條帶，當(dāng)使用F1/R1時(shí)，dNTP的終濃度為2.0mM/L時(shí)，特征條帶最亮。當(dāng)使用F2/R2時(shí)，dNTP的終濃度為2.5mM/L時(shí)，特征條帶最亮。因此，選擇終濃度為2.0mM/L和2.5mM/L分別作為其最適濃度。

2.1.3 引物濃度優(yōu)化

引物濃度優(yōu)化電泳圖見圖3，引物終濃度為0.8mM/L-2.4mM/L，當(dāng)使用F1/R1時(shí)，引物的終濃度為0.8mM/L時(shí)，引物二聚體最少，且特征條帶亮度很高，隨著引物濃度得增加出現(xiàn)了引物二聚體，說明引物有剩余。當(dāng)使用F2/R2時(shí)，引物的終濃度為1.2mM/L時(shí)，特征條帶最亮。因此，分別選擇0.8mM/L、1.2mM/L的引物濃度最為RT-PCR的最適終濃度。

2.1.4 退火溫度優(yōu)化

依據(jù)優(yōu)化后的組分配置反應(yīng)體系進(jìn)行RTPCR優(yōu)化退火溫度，電泳結(jié)果見圖4，退火溫度從50～65 ℃，均可擴(kuò)增出特征條帶，退火溫度分別為60 ℃、65 ℃時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶較亮，更高或更低退火溫度下擴(kuò)增，電泳條帶亮度有減弱趨勢(shì)，故分別選擇60℃、65℃為最適退火溫度。

綜合以上優(yōu)化的各反應(yīng)條件，當(dāng)使用引物F1/R1對(duì)IPNV進(jìn)行PCR反應(yīng)，確定其反應(yīng)條件為：

10×PCR Buffer 4.0 μL，dNTPs Mixture 4.0 μL，MgCl2（25mM） 2.0 μL，TaqPolymerase 0.5 μL，IPNV-F1（20 pmol/μL） 2.0 μL，IPNV-R1（20 pmol/μL）2.0 μL，cDNA 5.0 μL，ddH2O 30.5 μL，總計(jì) 50.0 μL。

使用引物F2/R2對(duì)IPNV進(jìn)行擴(kuò)增，本研究使用了一步法，經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定其反應(yīng)條件為：

10×E×Buffer 5.0 μL，MgCl2（25mM） 6.0 μL，dNTPs Mixture 5.0 μL，IPNV-F2（20 pmol/μL） 3.0 μL，IPNV-R2（20 pmol/μL） 3.0 μL，E×Taq E 0.5 μL，AMV（5 u/μL） 1.0 μL，RNaSin（40 u/μL）0.25 μL，RNA 5.0 μL，ddH2O 21.25 μL，總計(jì) 50.0 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min；接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s）；72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外拍照。

一步法RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃變性2 min；接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（95 ℃變性 30 s，65 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min）；72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外拍照。

2.2 RT-PCR的特異性試驗(yàn)

用IPNV的兩對(duì)引物對(duì)IPNV、IHNV、SVCV、VHSV和ISA進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果如圖5所示。用兩對(duì)引物檢測(cè)IPNV時(shí)，兩個(gè)陽性對(duì)照分別擴(kuò)增出了224 bp和206 bp的目的片段，其他RNA病毒和陰性對(duì)照沒有產(chǎn)生目的條帶，因此，兩對(duì)引物R1/F1、R2/F2具有很高的特異性。

2.3 RT-PCR靈敏度試驗(yàn)

10倍系列稀釋病毒RNA，每個(gè)稀釋度取5 μL進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果如圖6所示，隨著稀釋度的增加，條帶也逐漸的變暗，檢測(cè)結(jié)果的最大稀釋度為10-6，相應(yīng)的靈敏度為1pgRNA。

3 討論

RT-PCR技術(shù)是根據(jù)某個(gè)特定病毒的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過核酸的擴(kuò)增來達(dá)到檢測(cè)目的。對(duì)水生動(dòng)物病毒的檢測(cè)通常是先將病料在該病毒的敏感細(xì)胞中培養(yǎng)，初步觀察其病變情況，然后再進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，但是在沒有敏感細(xì)胞的情況下可對(duì)病料直接提取RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。而有關(guān)IPNV基因組的數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立，因此該方法可將致使魚發(fā)病的病毒鑒定到種。因此在水生動(dòng)物進(jìn)出口檢測(cè)和疾病預(yù)防中，RT-PCR技術(shù)成為了一個(gè)常用的手段。若在魚類病毒的檢測(cè)過程中，將RT-PCR技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合使用，其檢測(cè)靈敏度和病毒檢出率會(huì)更高。

本文通過優(yōu)化RT-PCR的反應(yīng)條件和體系，建立了應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)IPNV-Sp的方法，該方法特異敏感，并成功用此方法對(duì)人工感染IPNV的斑馬魚進(jìn)行了檢測(cè)。該方法對(duì)IHNV、SVCV、VHSV和ISA的核酸均沒有擴(kuò)增，其檢測(cè)極限為1 pg的RNA。

本文建立的RT-PCR方法中，針對(duì)IPNV片段A的VP5和VP3分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，一對(duì)引物用兩步法，另一對(duì)引物采用了一步法，通過比較發(fā)現(xiàn)一步法可以避免氣溶膠的形成，而采用兩步法時(shí)在陰性對(duì)照中出現(xiàn)了和目的片段大小相同的條帶，因此有可能是因?yàn)榭諝庵写嬖跉馊苣z。

[1]江育林，徐伯亥，李偉，等. 虹蹲傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）的初步研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，1989，13（4）：353-358.

[2]Williams K，Blake S，Sweeney A，et al. Multiplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection of three fish viruses[J]. Clin Microbiol，1999，37（12）：4139-4141.

[3]Alonso M，Rodriguez S，Perez Prieto S I .Nested PCR improves detection of infectious hematopoietic necrosis virus in cells coinfected with infectious pancreatic necrosis virus[J]. J Virol Methods，1999，81（1/2）：1-9.

[4]Cutrin J M，Lopez-Vazquez C，Olveira J G，et al. Isolation in cell culture and detection by PCR-based technology of IPNV-like virus fromLeucocytes of carrier turbot，Scophthalmus maximus（L.）[J]. J Fish Dis，2005，28（12）：713-722.