謝麗基，謝芝勛，龐耀珊，劉加波，鄧顯文，謝志勤

（廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001）

隨著養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴(kuò)大及密度的持續(xù)增高，貝類的病害也頻繁出現(xiàn)。目前，危害最嚴(yán)重的貝類原蟲有派琴蟲（Perkinsus sp）和折光馬爾太蟲（Marteilia refringens）。派琴蟲能使貝殼不能閉合，套膜收縮，性腺發(fā)育抑制，生長緩慢，偶爾也會(huì)出現(xiàn)膿腫，死亡率可高達(dá)95%[1-4]。馬爾太蟲可引起貝類消瘦、消化道變色、停止生長并死亡[5-6]。另外，更為嚴(yán)重的是，人們食用了感染派琴蟲的貝類還可能出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等不適癥狀。

派琴蟲和折光馬爾太蟲的傳統(tǒng)檢測方法有電鏡觀察、組織細(xì)胞學(xué)檢查、原位雜交和雷氏液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基（RFTM）等檢測方法，這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，缺乏專一性，在實(shí)際工作中具有一定的局限性[7-10]。病原檢測、篩選建立無特定病原體的健康群，仍然是目前預(yù)防與控制這些原蟲病的最有效辦法。PCR方法具有操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為動(dòng)物病原檢測的重要方法。至今仍未見有應(yīng)用二重PCR技術(shù)對(duì)貝類單孢子蟲和折光馬爾太蟲進(jìn)行檢測和診斷的報(bào)道。為了提高檢測準(zhǔn)確性和檢測效率，縮短檢測周期，本研究設(shè)計(jì)二對(duì)引物，建立了派琴蟲和折光馬爾太蟲的二重PCR快速檢測方法，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 PCR試劑盒及PMD18-T試劑盒購自大連寶生物公司； DNA片斷回收試劑盒購自BioDev公司；海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒購自天根公司；PCR儀為美國Perkin Elmer Cetus公司生產(chǎn)的PE9600儀。

1.2 菌株和DNA 嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌均購自中國農(nóng)業(yè)部動(dòng)植物病原庫；派琴蟲、折光馬爾太蟲、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和擬態(tài)弧菌等由本室保存；單孢子蟲的DNA由美國維吉尼亞海洋科學(xué)研究所的Nancy Stokes惠贈(zèng)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)派琴蟲和折光馬爾太蟲的基因保守序列，通過Blast驗(yàn)證，設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物（表1）。

表1 試驗(yàn)所使用引物序列

1.4 核酸抽提 取待檢貝類的鰓、心臟、消化腺組織等共約100 mg，勻漿后根據(jù)海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒的說明提取DNA。參照Sambrook方法測定核酸的濃度和純度[11]，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?duì)照菌株DNA的抽提按同樣方法進(jìn)行。

1.5 PCR擴(kuò)增介質(zhì)及PCR各反應(yīng)條件優(yōu)化 在100 uL的反應(yīng)體系中含：25mM MgCl25 uL，10×PCR buffer 10 uL，10mM dNTP 2 uL，Taq聚合酶5單位0.5 uL，適當(dāng)濃度的上游引物和下游引物、模板各5 uL。以抽提的DNA為模板，對(duì)PCR各循環(huán)參數(shù)和各引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的PCR模式。

1.6 PCR特異性試驗(yàn) 將已提取的派琴蟲、折光馬爾太蟲、單孢子蟲、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和擬態(tài)弧菌的DNA分別用多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其特異性。

1.7 PCR敏感性 測定派琴蟲和折光馬爾太蟲模板的DNA含量后，按10倍遞增稀釋，同時(shí)加入到最佳的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其敏感性。

1.8 PCR產(chǎn)物的電泳分析及克隆測序 取50 uL PCR產(chǎn)物分別與5 uL溴酚蘭混合，在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外光下觀察拍照，與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作比較，分析并記錄結(jié)果。在紫外燈下用刀片切割所需的片段，然后用凝膠回收試劑盒純化回收。取適量純化回收的PCR產(chǎn)物，與PMD18-T于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希氏菌。挑取在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上長出的白色菌落37 ℃培養(yǎng)，用堿裂解法抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR快速鑒定，陽性克隆菌送大連寶生生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

1.9 檢測臨床樣品 利用建立的貝類派琴蟲和折光馬爾太蟲二重PCR方法，對(duì)廣西沿海的119份牡蠣樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR條件優(yōu)化 通過對(duì)PCR的引物濃度、各反應(yīng)溫度、時(shí)間及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，最后確定PCR中Perkinsus1和Perkinsus2引物的最佳工作終濃度為0.5uM，Marteilia 1和Marteilia 2引物的最佳工作終濃度為0.4uM，PCR的最佳反應(yīng)模式為94 ℃變性5 min，然后進(jìn)入94 ℃變性1 min、57 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min的循環(huán)，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后再經(jīng)72℃延伸10 min后，于4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

2.2 PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果 應(yīng)用該程序?qū)ε汕傧x和折光馬爾太蟲核酸，及對(duì)照菌株（單孢子蟲、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和擬態(tài)弧菌）的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果含有派琴蟲和折光馬爾太蟲核酸模板的樣品均能擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的DNA擴(kuò)增帶；而其它對(duì)照菌株DNA在相同位置卻無任何DNA擴(kuò)增條帶（圖1）。

2.3 PCR的敏感性擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)過敏感性測定，該P(yáng)CR最低能檢出10 pg派琴蟲和折光馬爾太蟲的DNA模板（圖2）。

2.4 測序結(jié)果與序列分析 經(jīng)測序結(jié)果分析及Blast比對(duì)分析，證明了派琴蟲和折光馬爾太蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，大小分別為596 bp和478 bp，與設(shè)計(jì)大小相符。PCR產(chǎn)物的核酸序列與引物設(shè)計(jì)模板的基因?qū)?yīng)片段的同源性一致。

2.5 檢測臨床樣品 對(duì)廣西沿海的119份牡蠣樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出11份派琴蟲和2份折光馬爾太蟲陽性，陽性率分別為9.24%和1.68%。

3 討論

派琴蟲和折光馬爾太蟲是危害海水養(yǎng)殖貝類的重要病原體，在歐洲和大洋洲等國家的感染普遍存在[1-4，9，12-15]，在過去的二十多年里，我國從國外引進(jìn)了多種海洋貝類作為貝種用于海水養(yǎng)殖，但在進(jìn)口過程中都沒有進(jìn)行派琴蟲和折光馬爾太蟲感染的檢測，派琴蟲和折光馬爾太蟲可能會(huì)隨著貝類的引進(jìn)而進(jìn)入我國，并在不同貝類間傳播。因此迫切需要建立一種快速敏感的派琴蟲和折光馬爾太蟲檢測方法。目前國內(nèi)檢測這兩種原蟲的方法有組織和細(xì)胞學(xué)檢測法、電鏡檢測法和原位雜交法，但這些方法操作繁瑣費(fèi)時(shí)，在實(shí)際的工作中存在一定的局限性。

PCR方法具有操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，由于多重PCR反應(yīng)體系中存在二種以上的引物和模板，反應(yīng)過程中相互之間會(huì)有一定的影響，而且反應(yīng)總是有利于較小片段擴(kuò)增的原則，為使多重PCR中各片段都得到最佳擴(kuò)增，應(yīng)盡可能使各擴(kuò)增片段之間大小不要相差太懸殊，各引物所需擴(kuò)增條件接近一致，特別各引物退火因盡可能相同，最終確保二種擴(kuò)增產(chǎn)物量相對(duì)平衡。本試驗(yàn)中，我們根據(jù)派琴蟲和折光馬爾太蟲的基因序列設(shè)計(jì)出特異性引物，從而達(dá)到一次二重PCR擴(kuò)增，就可檢測鑒別派琴蟲和折光馬爾太蟲的目的。由于派琴蟲和折光馬爾太蟲在臨床上可能會(huì)出現(xiàn)混合感染，派琴蟲和折光馬爾太蟲二重PCR方法的建立就非常有意義。通過對(duì)引物用量和PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化，派琴蟲和折光馬爾太蟲二種引物的最佳工作濃度分別為0.5uM和0.4uM，說明了要使二重PCR反應(yīng)體系中每一目的片段都得到最佳擴(kuò)增結(jié)果，適當(dāng)?shù)囊餄舛仁鞘种匾摹?/p>

本研究建立的派琴蟲和折光馬爾太蟲二重PCR方法全程（包括核酸提取、熒光PCR擴(kuò)增）僅需約5 h，最低能同時(shí)檢出10 pg派琴蟲和折光馬爾太蟲的DNA模板，這說明該二重PCR與常規(guī)PCR一樣，都具有很高的敏感性，可以同時(shí)進(jìn)行派琴蟲和折光馬爾太蟲的檢測和鑒別，這對(duì)于在貝類派琴蟲和折光馬爾太蟲的發(fā)病早期提供準(zhǔn)確的診斷結(jié)果，切斷其傳播途徑有重要意義，同時(shí)這也是有效防制以上貝類原蟲病，選育建立無派琴蟲和折光馬爾太蟲病的健康貝類養(yǎng)殖群所必要的?？梢?，這些技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)貝類原蟲病的防制與凈化，保證貝類養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要的現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)食品安全也有著不可忽略的公共衛(wèi)生意義。

牡蠣是中國南方沿海養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)貝類，也是中國傳統(tǒng)的出口海產(chǎn)品。因此本研究應(yīng)用所建立的二重PCR技術(shù)，對(duì)取自對(duì)廣西沿海的119份牡蠣樣品進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果表明，在廣西沿海牡蠣中，派琴蟲和折光馬爾太蟲的感染率分別為9.24%和1.68%，結(jié)果提示在廣西沿海地區(qū)養(yǎng)殖貝類中存在派琴蟲和折光馬爾太蟲的感染。

[1]梁玉波，張喜昌，王立俊，等.北黃海菲律賓蛤仔帕金蟲流行病害的研究[J].海洋與湖沼，2001，32（5）：567-575.

[2]Hamaguchi M，Suzuki N，Usuki H，et al.Perkinsus protozoan infection in short-necked clam Tapes（=Ruditapes） philippinarum in Japan[J].Fish Pathol，1998，33（5）：473-480.

[3]Choi K S，Park K I. Report on the occurrence of Perkinsus spp in the Manila clams，Ruditapes philippinarum，in Korea[J]. J Kor Aquac Soc，1997，10：227-237.

[4]Powell E N，Klinck J M，Hofmann E E.Modeling diseased oyster populations.II. Triggering mechanisms for Perkinsus marinus epizootics[J]. J Shellf i sh Res，1996，15（1）：141-165.

[5]Audemard C，Barnaud A，Collins C M，et al. Claire ponds as an experimental model for Marteilia refringens life-cycle studies：new perspectives[J]. J Exp Mar Bio Ecol，2001，257（1）：87-108.

[6]Itoh N，Momoyama K，Ogawa K. First report of three protozoan parasites （a haplosporidian，Marteilia sp. and Marteilioides sp.）from the Manila clam，Venerupis （=Ruditapes） philippinarum in Japan[J]. J Invertebr Pathol，2005，88（3）：201-206.

[7]Lopez-Flores I，Robles F，Valencia JM，et al. Detection of Marteilia refringens using nested PCR and in situ hybridisation in Chamelea gallina from the Balearic Islands （Spain）[J]. Dis Aquat Organ，2008，82（1）：79-87.

[8]Carrasco N，Arzul I，Berthe FC，et al. In situ hybridization detection of initial infective stages of Marteilia refringens（Paramyxea） in its host Mytilus galloprovincialis[J]. J Fish Dis，2008，31（2）：153-157.

[9]Kleeman SN，Le Roux F，Berthe F，et al. Specificity of PCR and in situ hybridization assays designed for detection of Marteilia sydneyi and M. refringens[J]. Parasitology，2002，125（2）：131-141.

[10]Almeida M，Berthe F，Thebault A，et al. Whole clam culture as a quantitative diagnostic procedure of Perkinsus atlanticus（Apicomplexa，Perkinsea）in clams Ruditapes decussatus[J].Aquaculture，1999，177（1/4）：325-332.

[11]Sambrook J，F(xiàn)ritsh E T，Maniatis T. Molecular Cloning：a laboratory manuel [M]. New York：Cold Spring Harbor. Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

[12]Audemard C，Sajus MC，Barnaud A，et al. Infection dynamics of Marteilia refringens in flat oyster Ostrea edulis and copepod Paracartia grani in a claire pond of Marennes-Olon Bay[J]. Dis Aquat Organ，2004，61（1/2）：103-111.

[13]Lopez-Flores I，Garrido-Ramos MA，Herran R de la，et al.Identif i cation of Marteilia refringens infecting the razor clam Solen marginatus by PCR and in situ hybridization[J].Mol Cell Probes，2008，22（3）：151-155.

[14]Carrasco N，Lopez-Flores I，Alcaraz M，et al. Dynamics of the parasite Marteilia refringens （Paramyxea） in Mytilus galloprovincialis and zooplankton populations in Alfacs Bay（Catalonia，Spain）[J]. Parasitology，2007，134（11）：1541-1550.

[15]Russell S，F(xiàn)rasca S J，Sunila I，et al. Application of a multiplex PCR for the detection of protozoan pathogens of the eastern oyster Crassostrea virginica in fi eld samples[J]. Dis Aquat Org，2004，59（1）：85-91.