李 英

（山東省日照市五蓮縣畜牧獸醫(yī)局，山東五蓮 262300）

斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種病毒性傳染病。本病主要發(fā)生于4～14周齡的斷奶仔豬，是一種能夠感染多種組織器官的疾病，患豬主要表現(xiàn)為精神沉郁、漸進(jìn)性消瘦、呼吸困難和顯著的淋巴結(jié)腫大，偶爾有腹瀉、胃潰瘍和黃疸等癥狀。在急性暴發(fā)的情況下，發(fā)病率和死亡率會(huì)很嚴(yán)重，能達(dá)到4%～10%的發(fā)病率并有70%～80%的死亡率。感染豬容易繼發(fā)其它病毒性或細(xì)菌性疾病，使病情加重。

PMWS的病原是豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus，PCV），包括l型和2型兩種類型（PCV1，PCV2），其中PCV2是PMWS的致病原。豬圓環(huán)病毒的基因組中開(kāi)放閱讀框l（ORF1）和開(kāi)放閱讀框2（ORF2）是PCVl和PCV2共有的主要閱讀框，PCVl與PCV2的ORF2基因組同源性只有65%～67%。國(guó)內(nèi)外通常采用ORF2設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增PCV2基因片段，與PCVl不發(fā)生交叉反應(yīng)。圓環(huán)病毒對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，在酸性環(huán)境（pH3.0）及氯仿中可以存活較長(zhǎng)時(shí)間，在72 ℃能存活15 min，56 ℃不能將其滅活。

近來(lái)在日照市某些規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)現(xiàn)類似PMWS的病例，本研究采集病豬肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、血清等，用針對(duì)PCV開(kāi)放閱讀框2（ORF2）特異性的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病情況

豬場(chǎng)中5～12周齡的豬表現(xiàn)生長(zhǎng)受阻、消瘦，全身黃疸，滲出性皮炎等癥狀，病初，豬體溫上升至40℃，后降至正常。發(fā)病初眼結(jié)膜發(fā)黃，后出血；病初豬便秘，后嚴(yán)重便血，并死亡。

剖檢病變，全身貧血、黃疸，最顯著的變化是全身淋巴結(jié)特別是腹股溝淺淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)腫大，切面硬度增大。可見(jiàn)均勻的白色，有的出血，紅白相間。脾腫大、梗死。肺間質(zhì)性水腫，肺邊緣及部分區(qū)域?qū)嵶?，肺尖葉和心葉肺泡出血，顏色加深。腎臟顏色變深，被膜下有壞死灶。心肌及心冠狀脂肪出血，心肌有白色梗死區(qū)。肝臟黃疸，肝小葉間結(jié)締組織增生，切面有顆粒感。腸出血性卡他性炎癥，腸黏膜脫落。胃壁黏膜脫落，出血性潰瘍。

1.2 病料采取

本實(shí)驗(yàn)采集豬場(chǎng)中10頭表現(xiàn)PMWS癥狀的斷奶仔豬，取其肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、血清等病料，按l:5加pH7.2的Hank'S液，于滅菌組織研磨器中充分研磨成乳狀物，-20 ℃反復(fù)凍融3次，5000 r/min離心5 min，取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病料的細(xì)菌檢測(cè)

取心血、肝、肺、脾、膽囊等病料分別接種于血液瓊脂平板、普通瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板，進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.4 PCR檢測(cè)

1.4.1 試劑與材料

瓊脂糖、Taq酶、dNTP、DL2000 Marker等，試劑均購(gòu)自大連寶生物工程公司。標(biāo)準(zhǔn)PCV2毒株由日照市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存。

1.4.2 引物參考 Genbank中注冊(cè)的PCV2序列設(shè)計(jì)了針對(duì)PCV2開(kāi)放閱讀框2（0RF2）的特異性引物：

上游引物：5'-acctatcatccatcagaaacc-3'；

下游引物：3'-ttaggactgagaggagttgtt-5'

p1和下游引物p 2的擴(kuò)增片段長(zhǎng)952 bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，用滅菌擊離子水配成50 Pmol/uL溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 病料總DNA的提取

取300 ul上述病料上清液，加等體積的裂解液（20 mmol/uL Tris-CI PH8.0；0.5%SDS ），5 uL 蛋白酶K（20 mmol/uL），50 ℃消化 2 h。12000 r/min離心15 min取上清液．然后分別用等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇（V/V/V=25/24/1）提取組織中的總DNA，最后用乙醇沉淀DNA ，并將沉淀的DNA溶解在無(wú)DNA酶的TE（pH7.5）緩沖液中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 PCR擴(kuò)增

將上述抽提得到的總DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 uL，包括10×PCR緩沖液5 uL，dNTP（2.5 mmol/uL）4 uL，Mgcl2（25 mmol/uL）35 uL，引物P1，P2各1 uL，模板1 uL，Taq酶（ 5 u/uL ）0.5 uL，ddH2O34 uL。

反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，為1個(gè)循環(huán)；之后以 94 ℃ l min，50 ℃ l min，72 ℃ 1.5 min。共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取5 uLPCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖上電泳，于紫外燈下觀察，拍照并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

分別在脾、淋巴結(jié)和血清等病料中擴(kuò)增出大約952 bp的片段。與PCV2陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增的片段大小一致。陰性對(duì)照中沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶。所得結(jié)果如圖1。

2.2 細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果 病料接種的血瓊脂平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

3 討論

3.1 現(xiàn)已證實(shí)圓環(huán)病毒會(huì)導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（PMWS）的主要病原豬是圓環(huán)病毒的天然宿主，病毒通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播?；蛟谪i群中水平傳播，各種年齡、不同性別的豬都可感染生長(zhǎng)豬發(fā)病率高。多呈隱性感染，但4～16周齡的斷奶仔豬感染會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的PMWS等疾病。由于PMWS是一種免疫抑制性疾病。而且還懷疑PCV2與豬皮炎和腎臟綜合征、間質(zhì)性肺炎和繁殖障礙等疾病有關(guān)，往往會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的威脅和損失。

3.2 本研究中發(fā)病豬呈現(xiàn)的特征性臨床癥狀及病理變化與 PCV2感染引起的PMWS一致。利用PCR檢測(cè)方法可以快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地對(duì)PCV2病原進(jìn)行檢測(cè)。本研究為圓環(huán)病毒的快速準(zhǔn)確診斷提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]謝俊良，楊增岐，趙華，等.豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2006，23（11）：33-34.

[2]劉守媛.豬圓環(huán)病毒2型分子生物學(xué)及診斷方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2006，23（9）：45-47.