劉志強(qiáng)，王 平，單體江，孫偉波，劉 浩，孫文獻(xiàn)，周立剛*

1湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2湖南科技大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湘潭 411201;3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193

稻曲病(Rice false smut)是危害水稻的一種重要的真菌病害［1］。稻曲病病原為稻綠核菌，無性態(tài)學(xué)名為Ustilaginoidea virens(Cooke)Takahashi。有性態(tài)學(xué)名為Villosiclava virens(Nakata)Tanaka et Tanaka［2］。迄今，稻曲病菌中已闡明的次生代謝產(chǎn)物有兩類，第一類為黑粉菌素(Ustilaginoidins)，屬于萘并吡喃酮類;另一類為稻曲菌素(Ustiloxins)，屬于環(huán)肽類［3，4］。研究表明，稻曲菌素能夠抑制真核生物微管蛋白的組裝與細(xì)胞骨架的形成，抑制細(xì)胞有絲分裂，具有明顯的抗腫瘤活性，作為抗腫瘤藥物的開發(fā)具有較好的應(yīng)用前景［5-7］。我國對稻綠核菌中次生代謝產(chǎn)物的研究還十分初步，僅見對其粗提物的報道［8，9］。稻綠核菌在水稻穗部為害，形成主要由厚垣孢子和菌絲組成的稻曲球。尚未見稻曲球脂溶性成分的研究報道，本研究制備了稻曲球石油醚提取物，采用水蒸氣蒸餾法制備了石油醚提取物的油狀物，同時從石油醚提取物中分離到3個單體化合物，對其進(jìn)行了抗細(xì)菌和抗氧活性的測定，為稻曲球脂溶性成分的開發(fā)和利用提供依據(jù)，同時也為系統(tǒng)了解稻曲球中次生代謝產(chǎn)物的種類提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

稻曲球于2010年9月底采自遼寧省東港市，室溫晾干，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

水蒸氣蒸餾裝置(北京永光明醫(yī)療器械廠);GC-MS聯(lián)用儀(Agilent 6890 GC-5973 MSD，美國安捷倫公司);Bruker Avance DPX-300型和DRX-400型核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司);Apex IV型飛行時間質(zhì)譜儀(瑞士Bruker公司);VSP-3050型中低壓液相色譜儀(東京理化器械株式會社);XT4-100B型顯微熔點(diǎn)測定儀(北京科儀電光儀器廠);PowerWave HT多孔板分光光度計(jì)(美國BioTek公司)。

甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、二氯甲烷等均為市售分析純;薄層層析硅膠(GF254)和柱層析硅膠(60～80目和200～300目)均購自青島海洋化工有限公司;CDCl3(北京騰達(dá)遠(yuǎn)科技有限公司);Sephadex LH-20(Pharmacia公司);噻唑藍(lán)(MTT，美國Amresco公司);硫酸鏈霉素(Serva公司);其他試劑均為分析純。

1.3 化合物分離與純化

稻曲球6.0 kg，粉碎后用甲醇室溫(25℃)浸泡3次，每次7 d，合并濾液并濃縮至干(1964 g)，然后加入適量蒸餾水制成懸浮液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行液-液萃取，重復(fù)5次，合并萃取液并濃縮成浸膏。分別得石油醚萃取物310 g，乙酸乙酯萃取物136 g，正丁醇萃取物318 g，水層濃縮成浸膏1200 g。將石油醚萃取部分經(jīng)水蒸氣蒸餾，得油狀物 21.7 g。

將石油醚萃取物浸膏經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-丙酮(3∶1，v/v)洗脫，合并部分經(jīng)二氯甲烷-甲醇梯度(1∶0→0∶1，v/v)洗脫，經(jīng) Sephadex LH-20 凝膠柱層析和重結(jié)晶，得化合物1(30 mg)、化合物2(25 mg)和化合物3(8.5 mg)。

1.4 油狀物的GC-MS分析

GC條件:6890N Network氣相色譜儀(Agilent);色譜柱為HP-5石英毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 m ×0.25 μm，Agilent)。進(jìn)樣口溫度 250 ℃，傳輸線溫度240℃。程序升溫如下:起始柱溫50℃停留1.5 min;以10℃/min升至180℃，停留2 min;然后以6℃/min升至280℃，停留10 min。載氣為高純氦(99.999%);柱流量 1 mL/min。進(jìn)樣量 1.0 μL(分流比為 1∶20)。

MS條件:離子源溫度280℃;電離方式EI，電離能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍m/z 50～500 amu。

采用GC峰面積歸一化法確定各組分峰相對含量(Relative content)。依據(jù)C8-C40各正烷烴的保留時間，按Van den Dool和Kratz法來確定保留系數(shù)(Retention index，RI)［10］。各組分峰用 NIST Library(2002版)質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索，最后以質(zhì)譜匹配度和RI值匹配度最高的化學(xué)結(jié)構(gòu)為最佳鑒定結(jié)果，無RI值匹配的采用質(zhì)譜匹配度最高的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.5 抗細(xì)菌活性測定

所用的供試微生物枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis;縮寫為B.s.)為革蘭氏陽性細(xì)菌;黃瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymans，縮寫為 P.l.)、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens，縮寫為 A.t.)、番茄瘡痂病菌(Xanthomonas vesicatoria，縮寫為 X.v.)為革蘭氏陰性細(xì)菌。采用多孔板-MTT分光光度法測定樣品對細(xì)菌的最低抑制濃度(MIC)值［11］和半抑制濃度(IC50)值［12］，以硫酸鏈霉素為陽性對照。數(shù)據(jù)處理參考相關(guān)文獻(xiàn)［13］，根據(jù)抑制率(%)，查幾率值表，可得抑制率幾率值(Y)，將化合物濃度(μg/mL)換算成濃度對數(shù)(X)，即可求出線性方程(Y=aX+b)，根據(jù)線性方程可求出樣品的半抑制濃度(IC50)。

1.6 抗氧化活性測定

采用樣品對Fe2+螯合能力來評價其抗氧化活性［18］，具體測定步驟如下:先向96孔板中加入30 μL濃度為0.2 mg/L的FeCl2·4H2O溶液，然后加入50 μL不同濃度的樣品溶液，混合后再加入70 μL濃度為2.0 mg/L的菲啰嗪溶液，振蕩混勻，室溫下反應(yīng)10 min，然后用多孔板分光光計(jì)測定其在560 nm處的吸收值，每個處理4個重復(fù)，以乙二胺四乙酸(EDTA)為陽性對照。數(shù)據(jù)處理參考文獻(xiàn)［13，14］，設(shè)供試樣品濃度(μg/mL)為 Y，F(xiàn)e2+螯合率(%)為X，求得Fe2+螯合率回歸方程(Y=aX+b)，從而可以求出樣品對Fe2+螯合能力的有效中濃度(EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻曲球石油醚提取物油狀物的化學(xué)組成

通過水蒸氣蒸餾，從稻曲球石油醚提取物中獲得21.7 g油狀物，占石油醚提取物重量的7.0%，占稻曲球重量的0.36%(以干重為基礎(chǔ))。通過GCMS分析，各組分峰用NIST Library(2002版)質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索，共鑒定出14個成分，占總量的99.9%。采用GC峰面積歸一化法定量分析，計(jì)算出各成分的相對含量(見表1)，主要成分為14-甲基十五烷酸甲酯(30.09%)、棕櫚酸(10.52%)、10，13-十八碳二烯酸甲酯(37.31%)、十八烷酸甲酯(5.54%)和(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸(15.63%)，表明稻曲球產(chǎn)生的油狀物成分中主要為脂肪烴和脂肪酸酯類物質(zhì)。

表1 石油醚提取物油狀物的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of the oily fraction from petroleum ether extract

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色膏狀物(CHCl3);mp.81～86℃;ESI-MS m/z:281 ［M-H］-;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.34(2H，m，H-9，H-10)，2.34(2H，t，J=15.0，7.5 Hz，H-2)，2.01(m)，1.62(2H，m)，1.30(m)，0.88(3H，t，J=13.4，6.3 Hz，H-18);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:180.30(C-1)，130.16(C-9)，129.87(C-10)，14.26(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［15］，該化合物鑒定為油酸(Octadecenoic acid)。

化合物2:白色片狀晶體(CHCl3);mp.78～82℃;ESI-MS m/z:561［M-H］-;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:0.88(6H，t，J=13.4，6.4 Hz，CH3× 2)，1.25(76H，br，CH2×38)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［16，17］，該化合物鑒定為正四十烷(Tetracontane)。

化合物3:無色針狀晶體(CHCl3);mp.162～168℃;ESI-MS m/z 397［M+H］+;1H NMR(CDCl3，300 MHz)δ:5.57(1H，m，H-6)，5.38(1H，m，H-7)，5.17(2H，m，H-22，H-23)，3.63(1H，m，H-3)，1.04(3H，d，J=4.4 Hz，H-21)，0.95(3H，s，H-19)，0.92(3H，d，J=5.3 Hz，H-28)，0.84(3H，d，J=4.6 Hz，H-27)，0.82(3H，d，J=4.6 Hz，H-26)，0.63(3H，s，H-18);13C NMR(CDCl3，75 MHz)δ:38.4(C-1)，32.0(C-2)，70.5(C-3)，40.8(C-4)，139.8(C-5)，119.6(C-6)，116.3(C-7)，141.3(C-8)，46.3(C-9)，37.1(C-10)，21.1(C-11)，39.5(C-12)，43.3(C-13)，54.5(C-14)，28.2(C-15)，23.0(C-16)，56.0(C-17)，12.0(C-18)，16.3(C-19)，40.4(C-20)，21.6(C-21)，132.0(C-22)，135.6(C-23)，42.8(C-24)，33.1(C-25)，19.6(C-26)，19.9(C-27)，17.6(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［18］，該化合物鑒定為為麥角甾-5，7，22-三烯-3-醇 (Ergosta-5，7，22-trien-3-ol)。

2.3 抗細(xì)菌活性

麥角甾-5，7，22-三烯-3-醇(3)對 4 種供試細(xì)菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性(表2)，其中對黃瓜角斑病菌的抑制活性最強(qiáng)，MIC值和IC50值分別為30.0 μg/mL和25.70 μg/mL。石油醚提取物油狀物僅對枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出弱的抑制活性，MIC值和IC50值分別為 150.0 μg/mL 和 148.29 μg/mL。油酸(1)和正四十烷(2)未檢測出抗細(xì)菌活性。

表2 麥角甾-5，7，22-三烯-3-醇和油狀物的抗細(xì)菌活性Table 2 Antibacterial activity of ergosta-5，7，22-trien-3β-ol and the oily fraction

2.4 抗氧化活性

采用螯合鐵離子的能力來評價樣品的抗氧化活性，油酸(1)和正四十烷(2)以及油狀物均表現(xiàn)出一定的螯合亞鐵離子能力(表3)，其EC50值分別為74.82 μg/mL、23.58 μg/mL 和 37.88 μg/mL，以正四十烷的螯合能力最強(qiáng)。麥角甾-5，7，22-三烯-3-醇(3)未檢測出螯合亞鐵離子的活性。

表3 化合物對Fe2+的螯合能力Table 3 Fe2+chelating activity of components

3 討論

稻曲球主要由稻曲病菌的厚垣孢子和菌絲組成，本研究結(jié)果表明稻曲球能產(chǎn)生多種脂肪烴和脂肪酸酯類化合物，這些化合物在稻曲病菌致病過程中的生理生態(tài)功能值得深入研究。稻曲球中的脂溶性成分具有一定的抗菌和抗氧化活性，提示稻曲球除用于制備稻曲菌素(一類具有應(yīng)用潛力的抗腫瘤活性成分［5-7］)外，還可用于制備脂溶性活性成分，這為稻曲球活性成分的開發(fā)與利用提供了依據(jù)。本論文是首次對稻曲球中脂溶性成分及其生物活性的報道。稻曲球其他成分的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性評價正在進(jìn)行之中。

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