陳 婧，王 斌，李德明，潘 力

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006）

疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶在無(wú)孢黑曲霉中的高效表達(dá)

陳 婧，王 斌，李德明，潘 力*

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006）

綜合考慮密碼子偏愛(ài)性、RNA穩(wěn)定性以及自由能等因素，對(duì)疏棉狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosus）耐熱脂肪酶（tll）基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化并全基因合成。將合成的tll基因連接到克隆載體，然后亞克隆到表達(dá)載體pHGWPT-tll，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化無(wú)孢黑曲霉SH-2。經(jīng)過(guò)三丁酸甘油酯平板、SDS-PAGE以及Western Blotting鑒定，成功表達(dá)了tll基因。發(fā)酵72h，轉(zhuǎn)化子脂肪酶酶活最高達(dá)36U/mL。轉(zhuǎn)化子經(jīng)等離子誘變得到的突變株的脂肪酶比活力比出發(fā)菌株提高約37%。

疏棉狀嗜熱絲孢菌，耐熱脂肪酶，黑曲霉，重組表達(dá)

Abstract：We optimized the codon usage of Thermomyces lanuginosus lipase（tll） gene based on codon usage bias，RNA stability and free energy，and synthesized the optimized tll gene.The obtained tll gene was inserted into a clone vector，and then subcloned to the expression vector pHGWPT-tll.The vector pHGWPT-tll was transformed into non-spore Aspergillus niger SH-2 via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation using hygromycin B resistant gene as the selection marker.A.niger transformants bearing the tll gene，were selected by tributyrin hydrolyzing plate.The recombinant protein was verified by SDS-PAGE and Western blotting.After 72h fermentation，the lipase activity of transformants reached 36U/mL.Furthermore，the tll transformants was subjected to mutagenesis via atmospheric and room temperature plasma（ARTP）.The specific activity of the mutants was 37%higher than that of the original transformants，suggesting that tll gene could be highly expressed in A.niger.

Key words：Thermomyces lanuginosus；thermostable lipase；Aspergillus niger；recombinant expression

黑曲霉具有很強(qiáng)的蛋白分泌能力[1]，蛋白產(chǎn)量可達(dá)到30g/L以上[2]，是重要的蛋白生產(chǎn)平臺(tái)之一[2-4]，被美國(guó)FDA認(rèn)定為安全菌株（GRAS），使其在各領(lǐng)域中受到的關(guān)注與日俱增[5]。隨著根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（Arobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT）在絲狀真菌中的成功應(yīng)用[6-10]，黑曲霉更多被作為轉(zhuǎn)化宿主進(jìn)行外源基因表達(dá)[11]。一般黑曲霉分生孢子頭呈褐黑色、分生孢子梗長(zhǎng)短不一（圖1A），本研究使用的無(wú)孢黑曲霉為工業(yè)誘變菌，有很強(qiáng)的糖化酶分泌能力，不產(chǎn)孢子、菌落呈乳白色且菌絲短?。▓D1B）。粗短的菌絲易形成小而松散的菌球，有益于代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[12]，因此該菌擁有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。疏棉狀嗜熱絲孢菌（T.lanuginosus）是一種嗜熱真菌，其脂肪酶具有專(zhuān)一性強(qiáng)、選擇性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[13]，廣泛應(yīng)用于有機(jī)酸合成[14]、食物加工及油的水解等行業(yè)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。Wai Prathumpai等[15]將其在黑曲霉（NW297-14和NW297-24）中表達(dá)，以硝基苯基丁酸為底物，酶活達(dá)到6U/mL；鄭艷等[16]以畢赤酵母為宿主，以橄欖油為底物，酶活達(dá)到7.2U/mL。目前，還沒(méi)有將疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶在無(wú)孢黑曲霉中表達(dá)的報(bào)道。本研究使用黑曲霉糖化酶啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)tll基因轉(zhuǎn)化至無(wú)孢黑曲霉SH-2，然后使用突變率高、突變譜廣、重復(fù)性好[17]的等離子誘變技術(shù)進(jìn)行誘變，實(shí)現(xiàn)tll在無(wú)孢黑曲霉中的高效重組表達(dá)。

圖1 淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑曲霉MA169.4和無(wú)孢黑曲霉SH-2Fig.1 Aspergillus niger MA169.4 and Sporeless Aspergillus niger SH-2 cultured on solid starch medium

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉SH-2 糖化酶生產(chǎn)企業(yè)；根癌農(nóng)桿菌LBA4404 廣東省農(nóng)科院；疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶基因tll（3’端添加His6組氨酸標(biāo)簽）南京金斯瑞生物科技有限公司合成；雙元表達(dá)載體質(zhì)粒pHGW（含潮霉素抗性基因HygBr）比利時(shí)植物學(xué)研究中心（VIB）；大腸桿菌Mach1T1、ccdB Survival 本實(shí)驗(yàn)室保藏；潮霉素 美國(guó)Merck公司；乙酰丁香酮sigma-aldrich公司；三丁酸甘油酯 百靈威公司；限制性?xún)?nèi)切酶 美國(guó)Fermentas公司；PCR引物 Invitrogen合成；LC、IM和MM培養(yǎng)基[9]，淀粉培養(yǎng)基（g/L） 牛肉膏3，蛋白胨10，酵母粉2，淀粉10，NaCl 2，瓊脂粉17，pH5.5；CD培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖20，硝酸鈉3，KCl 0.5，MgSO40.5，K2HPO41、FeSO40.01，瓊脂粉15，pH5.5。

Centrifuge5418型離心機(jī)、Mastercycler gradient PCR儀 德國(guó)eppendorf公司；?KTA explorer蛋白純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；ARTP生物育種機(jī) 北京思清源生物科技公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐熱脂肪酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建 利用引物Sig-forward/Sig-reverse PCR擴(kuò)增黑曲霉糖化酶基因的信號(hào)肽及起始密碼子ATG上游10bp序列（Kozak序列）；利用引物TLL-forward/TLL-reverse PCR擴(kuò)增經(jīng)密碼子優(yōu)化的tll基因，再利用融合PCR，將上述兩個(gè)片段連接成一個(gè)DNA片段，命名為Sig-tll。

以黑曲霉基因組DNA為模板，利用引物PglaA-forward/PglaA-reverse擴(kuò)增黑曲霉糖化酶啟動(dòng)子（PglaA），利用引物TglaA-forward/TglaA-reverse擴(kuò)增糖化酶終止子（TglaA），再利用融合PCR，將上述兩個(gè)片段連接成一個(gè)DNA片段，命名為PT。PT片段經(jīng)連接克隆載體pSIMPLE-18 EcoRV/BAP Vector后，測(cè)序驗(yàn)證正確后用HindIII/XbaI雙酶切亞克隆到農(nóng)桿菌雙元載體pHGW，命名為pHGWPT。

用PvuII酶切質(zhì)粒pHGWPT并去磷酸化處理，將片段Sig-tll經(jīng)磷酸化處理后連接到質(zhì)粒pHGWPT上的啟動(dòng)子（PglaA）和終止子（TglaA）之間，通過(guò)PCR篩選方向性，挑選方向正確的重組子測(cè)序驗(yàn)證，質(zhì)粒命名為pHGWPT-tll。所有引物序列見(jiàn)表1。

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)耐熱脂肪酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化無(wú)孢黑曲霉SH-2 參照朱錦輝等[18]報(bào)道的方法，將構(gòu)建的pHGWPT-tll表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

參照Caroline B Michielse等[9]報(bào)道的轉(zhuǎn)化方法，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)pHGWPT-tll轉(zhuǎn)化無(wú)孢黑曲霉SH-2并得到轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子單菌落轉(zhuǎn)接至含0.5%（v∶v）三丁酸甘油酯的CD固體培養(yǎng)基（三丁酸甘油酯平板）上，30℃培養(yǎng)2d，觀察轉(zhuǎn)化子周?chē)袩o(wú)水解圈出現(xiàn)，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步鑒定。分別提取宿主菌SH-2和轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，利用引物glaA-forward/glaA-reverse、TLL-forward/TLL-reverse及hygB-forward/hygB-reverse分別擴(kuò)增黑曲霉糖化酶基因（glaA，約1kb）、耐熱脂肪酶基因（Sig-tll，約1kb）及潮霉素抗性基因（HygBr，約1kb）進(jìn)行鑒定。

使用2%糖（1%葡萄糖+1%麥芽糖）為碳源的YPD培養(yǎng)基，30℃，250r/min，分別對(duì)宿主菌SH-2和轉(zhuǎn)化子發(fā)酵3d。攜帶His6組氨酸標(biāo)簽的tll蛋白能與親和層析柱牢固結(jié)合而進(jìn)行有效洗脫，因此將發(fā)酵液離心過(guò)濾后使用His-tag親和層析柱純化，純化后轉(zhuǎn)化子的tll蛋白使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定濃度；以橄欖油為底物，采用標(biāo)準(zhǔn)方法[19-20]測(cè)定脂肪酶活力；并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)和Western Blotting進(jìn)一步鑒定。酶活力單位定義為每分鐘催化底物水解產(chǎn)生1μmol脂肪酸的酶量。

1.2.3 等離子突變株的選育及鑒定 使用ARTP育種機(jī)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行等離子誘變。參照樣品制備流程制備樣品，選取時(shí)間梯度30、60、90、120、180s進(jìn)行誘變，誘變后的菌液分別稀釋50、500、5000倍涂布于淀粉培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5d。挑取菌落大的單菌落轉(zhuǎn)接于三丁酸甘油酯平板上，通過(guò)水解圈的大小初步判斷脂肪酶活力，對(duì)突變株進(jìn)行篩選。

表1 PCR引物序列Table 1 The sequences of PCR primers

經(jīng)過(guò)二次篩選，選定水解圈最大的突變株單菌落研究，30℃、250r/min對(duì)其發(fā)酵，測(cè)定純化后突變株tll蛋白的濃度和脂肪酶活力。

1.2.4 耐熱脂肪酶的生物學(xué)特性 耐熱脂肪酶的最適反應(yīng)溫度：選取溫度梯度50、55、60、65、70、75、80℃，以橄欖油為底物進(jìn)行脂肪酶活測(cè)定，酶活最高時(shí)的溫度即為重組耐熱脂肪酶的最適反應(yīng)溫度。

耐熱脂肪酶的最適反應(yīng)pH：以橄欖油為底物，調(diào)整反應(yīng)緩沖液pH分別為3.0、5.0、7.0、8.0、9.0、11.0，進(jìn)行脂肪酶活測(cè)定，酶活最高時(shí)的pH即為重組耐熱脂肪酶的最適反應(yīng)pH。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐熱脂肪酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)融合PCR擴(kuò)增耐熱脂肪酶基因（Sig-tll），電泳結(jié)果顯示基因片段大小與預(yù)計(jì)一致（圖2A），通過(guò)亞克隆得到耐熱脂肪酶的表達(dá)載體pHGWPT-tll（圖2B）。HindIII/XbaI雙酶切表達(dá)載體pHGWPT-tll，得到與目的片段大小相符的片段（約2.7K，圖2C），表明耐熱脂肪酶表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 Sig-tll基因的擴(kuò)增及耐熱脂肪酶表達(dá)載體的酶切鑒定Fig.2 PCR amplification of Sig-tll gene and identification of its expression vector by enzyme digestion

2.2 黑曲霉轉(zhuǎn)化子的鑒定

挑選MM培養(yǎng)基上菌落大的單菌落（圖3A），轉(zhuǎn)移至三丁酸甘油酯平板。培養(yǎng)2d，出現(xiàn)水解圈的菌落，初步確定為轉(zhuǎn)化子，而宿主菌SH-2菌落周?chē)鸁o(wú)水解圈（圖3B）。

圖3 pHGWPT-tll表達(dá)載體轉(zhuǎn)化無(wú)孢黑曲霉SH-2Fig.3 Transformation of sporeless A.niger SH-2 with expression vector pHGWPT-tll

分別以宿主菌SH-2和轉(zhuǎn)化子的基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增所得的glaA、HygBr及Sig-tll片段大小與預(yù)計(jì)一致（圖4A），且Sig-tll基因測(cè)序結(jié)果與原始序列一致，證實(shí)所得轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性克隆。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子在32ku處有蛋白條帶，與tll蛋白大小相符[16]，Western Blotting鑒定表明，轉(zhuǎn)化子有對(duì)應(yīng)耐熱脂肪酶tll的條帶，而宿主菌SH-2沒(méi)有（圖4B），進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)化子成功表達(dá)疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶。

圖4 轉(zhuǎn)化子的鑒定Fig.4 Verification of transformant

2.3 等離子突變株的鑒定

對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行等離子誘變，經(jīng)二次篩選得到突變株。結(jié)果顯示，宿主菌SH-2（圖5A，1）在三丁酸甘油酯平板不形成水解圈，轉(zhuǎn)化子（圖5B，1）形成明顯的水解圈。對(duì)水解圈最大的突變株（圖5B，2）進(jìn)行發(fā)酵，純化后轉(zhuǎn)化子、突變株tll蛋白的濃度、脂肪酶活力及酶的比活力見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，雖突變株和轉(zhuǎn)化子的脂肪酶活力相差不大，但同轉(zhuǎn)化子相比，突變株的比活力提高37%。此外，轉(zhuǎn)化子和突變株的脂肪酶活力分別達(dá)到36、35U/mL，遠(yuǎn)高于疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶在畢赤酵母中的表達(dá)水平（7.2U/mL）[16]。

圖5 等離子突變株的篩選Fig.5 Screening of lipase mutant

表2 純化后轉(zhuǎn)化子、突變株tll蛋白濃度、酶活力及酶的比活力Table 2 Protein concentration,enzyme activity and specific activity of tll after purification

2.4 耐熱脂肪酶最適反應(yīng)溫度及最適反應(yīng)pH

不同pH緩沖液環(huán)境下，分別測(cè)定宿主菌SH-2和突變株的脂肪酶活力。結(jié)果顯示，宿主菌SH-2的脂肪酶活力在緩沖液pH為3.0～11.0之間較低且沒(méi)有明顯變化；突變株在緩沖液pH為3.0～11.0區(qū)間脂肪酶活力較高，且在緩沖液pH8.0時(shí)，酶活力最高，超過(guò)pH8.0酶活力顯著下降。

在不同溫度下分別測(cè)定宿主菌SH-2和突變株的脂肪酶活力。結(jié)果顯示，宿主菌SH-2的脂肪酶活力在50～80℃之間較低且無(wú)較大變化；突變株則在50～60℃區(qū)間保持較高酶活力，且酶活力在60℃時(shí)達(dá)到最高，超過(guò)60℃，酶活力顯著下降。上述結(jié)果與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)基本一致[18]。

圖6 耐熱脂肪酶最適反應(yīng)pH及最適反應(yīng)溫度Fig.6 The optimum pH and optimum temperature of the tll lipase

3 結(jié)論

疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶具有作用溫度高、副產(chǎn)物少、作用穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，得到越來(lái)越多的關(guān)注。該酶?jìng)鹘y(tǒng)的生產(chǎn)方法是通過(guò)內(nèi)源分泌得到的，產(chǎn)物量少、質(zhì)量參差不齊、無(wú)法產(chǎn)業(yè)化等限制了其應(yīng)用。目前，對(duì)疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶的重組表達(dá)研究較少，國(guó)外Wai Prathumpai等使用米曲霉淀粉酶啟動(dòng)子將其在黑曲霉（NW297-14和NW297-24）中表達(dá)，但是酶活力較低。本研究對(duì)疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其自由能由-291.9kcal/mol降至-303.3kcal/mol。自由能降低，大大減少了mRNA兩端二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，增加mRNA穩(wěn)定性從而提高蛋白表達(dá)量。研究使用黑曲霉自身糖化酶強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建質(zhì)粒，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至無(wú)孢黑曲霉SH-2，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)后，穩(wěn)定性良好且脂肪酶活力達(dá)到36U/mL。在此基礎(chǔ)上，使用等離子誘變技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘變，效果顯著，實(shí)現(xiàn)了耐熱脂肪酶在無(wú)孢黑曲霉的重組高效表達(dá)。

本文采用的潮霉素抗性基因（HygBr）雖然在真菌研究中應(yīng)用極為廣泛，但潮霉素是一種細(xì)菌毒素，屬于氨基環(huán)多醇類(lèi)抗生素，它可通過(guò)干擾蛋白合成而抑制原核和真核生物的生長(zhǎng)，這極大的限制了其在食品等工業(yè)的應(yīng)用。因此選擇一種能夠應(yīng)用于食品工業(yè)的篩選標(biāo)記如營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)型選擇標(biāo)記，使其能夠廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供條件，這將是本課題今后深入研究的方向。

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Effectively expression of Thermomyces lanuginosus thermostable lipase in non-spore Aspergillus niger

CHEN Jing，WANG Bin，LI De-ming，PAN Li*
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China）

TS201.3

A

1002-0306（2012）20-0160-40

2012-04-23 *通訊聯(lián)系人

陳婧（1987-），女，碩士研究生，研究方向：工業(yè)微生物。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30970045）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃（2011AA100905）。