韓 雪，梁金鐘

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076)

產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌菌株的分離鑒定

韓 雪，梁金鐘*

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076)

利用BCP培養(yǎng)基從酸菜汁中分離出兩株菌株，經(jīng)多次純化得到純菌株，編號分別為LpL328、ST328，初篩后發(fā)現(xiàn)LpL328具有較好的產(chǎn)γ－氨基丁酸（GABA）的能力，通過形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)初步鑒定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。將LpL328菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集菌體制成丙酮干粉，利用透性細(xì)胞與底物谷氨酸鈉反應(yīng)生成γ－氨基丁酸（GABA），通過比色法測定出LpL328轉(zhuǎn)化GABA的產(chǎn)率為2.16g/L。

GABA，γ－氨基丁酸，乳酸菌，分離鑒定，發(fā)酵

γ－氨基丁酸又叫氨酪酸、4－氨基丁酸，分子式是（4－Aminobutanoiacid，4－AB，簡稱GABA），相對分子質(zhì)量為103.12[1]，它是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在動物[2－3]、植物[4]、微生物[5]中均有分布，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[6]。GABA具有很多重要的生理功能，已報(bào)道的生理功能包括降低血壓、控制哮喘、促進(jìn)睡眠、預(yù)防和治療癲癇[7]、健肝利腎、預(yù)防肥胖、促進(jìn)乙醇代謝（醒酒）、改善更年期綜合癥等[8－9]，其已成為一種新型活性因子，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥與食品領(lǐng)域并成為研究熱點(diǎn)[10－11]。谷氨酸脫羧酶（Glutamate，簡稱GAD或GDC，也是GABA生物合成的限速酶[12]），能夠催化谷氨酸（Glutamic acid，Glu）合成GABA。GABA的合成方法有化學(xué)法、植物富集提取法和微生物發(fā)酵法。乳酸菌作為一類安全的微生物廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)中，具有多種耐酸機(jī)制，最新的一些研究報(bào)道稱，天然乳酸菌的耐酸生長機(jī)制可能與它們含有的GAD活力有關(guān)[13－14]，可以利用它們生物合成GABA[15]，這啟示我們可以采取乳酸菌發(fā)酵技術(shù)獲得GABA。本實(shí)驗(yàn)從酸菜中分離出一菌株，研究了其產(chǎn)GABA的能力，能夠?yàn)榻窈蠊I(yè)化生產(chǎn)GABA打下初步基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸菜汁 購自農(nóng)貿(mào)市場；γ－氨基丁酸（分析純）上海阿拉丁公司；正丁醇（分析純） 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸（分析純） 沈陽市新西試劑廠；硅膠板 青島海洋化工廠分廠；L－谷氨酸（LGlu） 中國惠世生化試劑有限公司；磷酸吡哆醛（PLP） 北京金鑫天佑生物科技有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純；BCP培養(yǎng)基（乳酸菌分離培養(yǎng)基），MRS液體培養(yǎng)基，MRS固體培養(yǎng)基，TYG培養(yǎng)基。

電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海中安醫(yī)療機(jī)械廠；HNY－100B恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器表有限公司；LG10－2.4A高速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；721可見分光光度計(jì) 天津市普瑞斯儀器有限公司；DHG－9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；SBA－40D生物傳感分析儀 山東生命科學(xué)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離純化 吸取1mL酸菜汁，加入到裝有9mL滅菌生理鹽水的試管中，依次稀釋至10－1、10－2、10－3、10－4、10－55個稀釋度，分別取10－3、10－4兩個稀釋度的稀釋液0.5mL置于BCP培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，37℃培養(yǎng)48h。選擇長勢較好的平板，挑取單菌落再次轉(zhuǎn)接至BCP培養(yǎng)基中，如此反復(fù)進(jìn)行4～5次，至菌落性狀較為穩(wěn)定時(shí)轉(zhuǎn)接至MRS斜面中進(jìn)行保存。

1.2.2 菌種產(chǎn)GABA能力的初步鑒定 將篩選出來的菌株轉(zhuǎn)接在MRS液體培養(yǎng)基中，37℃活化培養(yǎng)24h，以1%的接種量轉(zhuǎn)接于TYG發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃發(fā)酵培養(yǎng)48h。將發(fā)酵液離心，8000r/min，離心15min，取上清液進(jìn)行薄層層析分析。

1.2.3 菌種的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定 挑取BCP平板中的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)，之后對菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，包括糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 菌種的培養(yǎng)及菌體透性細(xì)胞的制備 將斜面中保藏的菌種轉(zhuǎn)接入MRS液體培養(yǎng)基活化24h，連續(xù)進(jìn)行兩次活化。之后按1%的接種量接入TYG發(fā)酵培養(yǎng)中培養(yǎng)48h。

取發(fā)酵液離心，8000r/min，15min，棄去上清液，加入無菌生理鹽水制成懸菌液，8000r/min，離心15min，棄去上清液，加入無菌生理鹽水?dāng)嚢?min，離心15min，棄去上清液，加入預(yù)先冷凍好的丙酮（菌體∶丙酮= 1∶10）充分?jǐn)嚢?0min，離心，如此反復(fù)2次，最后用風(fēng)機(jī)吹干，菌體中的丙酮必須除去否則影響酶活性，所得丙酮粉（即透性細(xì)胞）稱重留冰箱備用。

1.2.5 細(xì)胞反應(yīng)液中GABA的測定 Berthlot[16]比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取0.4mL 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1mol/L的Na2CO3溶液0.1mL，然后加入0.2mol/L的四硼酸鈉溶液0.5mL，再加入6%的苯酚溶液1mL，混勻后在5min之內(nèi)加入10%的次氯酸鈉溶液1mL，放置8～10min，沸水浴10min，之后冰浴20min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后加入60%的乙醇溶液2mL，20℃下水浴30min。以GABA的濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，OD640nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離純化

經(jīng)過分離純化得到10株菌株，其中有兩株菌株使BCP培養(yǎng)基菌落周圍變黃色，說明該菌株產(chǎn)生乳酸，在BCP培養(yǎng)基上分別呈現(xiàn)出兩種不同的菌落形態(tài)：一株菌株呈規(guī)則圓形，中央凸起，直徑大約為1mm，表面較為光滑，乳白色，菌落形態(tài)見圖1，挑取時(shí)有一定粘性，經(jīng)鏡檢為球菌，編號為ST328；另一株菌株呈針尖狀大小，較為透明，菌落形態(tài)見圖2，經(jīng)鏡檢為桿菌，編號為LpL328。

圖1 ST328菌落形態(tài)Fig.1 Colony of strain ST328

圖2 LpL328菌落形態(tài)Fig.2 Colony of strain LpL328

2.2 菌種產(chǎn)GABA能力的初步鑒定

將分離純化的兩株菌分別在MRS液體培養(yǎng)基中活化24h后，按1%接種量轉(zhuǎn)接到TYG發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃靜置培養(yǎng)48h，得到發(fā)酵液進(jìn)行離心，8000r/min，15min，取上清液進(jìn)行薄層層析。利用0.25%茚三酮作為顯色劑。與標(biāo)準(zhǔn)品GABA的樣點(diǎn)比較Rf值，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中可能含有GABA，結(jié)果如圖3所示。由薄層層析結(jié)果可以看出，ST328發(fā)酵液的點(diǎn)顯色較淺，而LpL328發(fā)酵液的點(diǎn)顯色較為明顯，說明此菌株具有相對較好的產(chǎn)GABA的能力，故對LpL328進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖3 薄層層析結(jié)果Fig.3 Result of thin layer chromatography

2.3 菌種的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 產(chǎn)GABA的菌種經(jīng)過革蘭氏染色確定為革蘭氏陽性菌，呈短桿狀，結(jié)果見圖4。

圖4 菌株形態(tài)特征Fig.4 Microscopic observation of strain LpL328

2.3.2 生理生化鑒定 吲哚實(shí)驗(yàn)：在試管中挑取單菌落接入蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃下靜置培養(yǎng)48h后，向培養(yǎng)基中加入3～4滴乙醚，搖動數(shù)次，靜置1min，待乙醚上升后沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑，若乙醚與培養(yǎng)物之間產(chǎn)生粉紅色環(huán)狀物為陽性反應(yīng)，結(jié)果見表1。

石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)：在試管中挑取單菌落接入石蕊牛奶中，37℃靜置培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果，如石蕊牛奶變粉色并產(chǎn)生凝固現(xiàn)象為陽性反應(yīng)，結(jié)果見表1。

過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)：將3%～10%的過氧化氫取一滴滴在干凈的載玻片上，將一環(huán)菌種在過氧化氫中涂抹，若有氣泡產(chǎn)生則為陽性，無氣泡則為陰性，也可將過氧化氫直接滴在試管中觀察，結(jié)果見表1。

表1 菌株生理生化試驗(yàn)Table 1 Biochemical properties of strain

從表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，吲哚實(shí)驗(yàn)中蛋白胨水培養(yǎng)基中有紅色環(huán)狀物產(chǎn)生，證明呈陽性；石蕊牛奶變色并有凝固現(xiàn)象出現(xiàn)，呈陽性；接觸酶實(shí)驗(yàn)未產(chǎn)生氣泡，呈陰性。

將培養(yǎng)好的試管斜面菌株分別接入20種糖發(fā)酵管中，37℃下靜置培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果，結(jié)果見表2。

從表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中的菌株不消耗木糖、核糖、阿拉伯糖及鼠李糖，呈陰性，其他均呈陽性。

根據(jù)上述生理生化實(shí)驗(yàn)，確定該菌為革蘭氏陽性乳桿菌，吲哚實(shí)驗(yàn)為陽性，接觸酶實(shí)驗(yàn)、石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中菌株不消耗木糖、核糖、阿拉伯糖及鼠李糖。根據(jù)伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊（第九版），綜合以上現(xiàn)象，初步確定此菌種為植物乳桿菌。

2.4 細(xì)胞反應(yīng)液中GABA含量的測定

將收集的丙酮干粉（即透性細(xì)胞）磨細(xì)后，用pH4.2～4.8的乙酸－乙酸鈉緩沖液，按2%、4%、6%、8%、10%的濃度分別配制成透性細(xì)胞緩沖溶液，在1mmol/L的PLP作用下與5g/L的底物L(fēng)－Clu進(jìn)行反應(yīng)，37℃下200r/min搖床反應(yīng)20h，并且以同樣操作的不加底物的細(xì)胞緩沖液作為空白。之后將反應(yīng)液離心，取上清液進(jìn)行定性及定量測定。

2.4.1 細(xì)胞反應(yīng)液中GABA的定性測定 將反應(yīng)后的細(xì)胞液離心取上清液，進(jìn)行薄層層析。展開劑為正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2，顯色劑為0.25%的茚三酮。將谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液、GABA標(biāo)準(zhǔn)液、反應(yīng)上清液、發(fā)酵上清液用進(jìn)樣器依次點(diǎn)在薄層板上，晾干后放入層析缸中，約2h后取出晾干噴灑茚三酮，待干燥后放入80℃烘箱中顯色15min，結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，發(fā)酵液的點(diǎn)顯色較淺，說明GABA含量較少；反應(yīng)液的點(diǎn)顯色較深，GABA含量明顯高于發(fā)酵液，說明細(xì)胞反應(yīng)能夠更有效地轉(zhuǎn)化底物L(fēng)－Clu為GABA，而具體含量需進(jìn)一步確定。

圖5 薄層層析結(jié)果Fig.5 Result of thin layer chromatography

2.4.2 細(xì)胞反應(yīng)液中GABA的定量測定 GABA的檢測方法有很多種，包括酶法、放射受體法、薄層掃描法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、氨基酸分析儀檢測等。以上方法不適合大量樣品的測定，而利用Berthelot反應(yīng)的比色法經(jīng)驗(yàn)證是一種適合大量樣品測定的較為準(zhǔn)確的檢測GABA的方法，其原理是利用苯酚、次氯酸鈉和游離氨發(fā)生顯色反應(yīng)，具有較高的靈敏度，可用于測定不同體系中的微量氨和鹽類。

以GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度C為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出的回歸方程為y=1.505x－0.0038，相關(guān)系數(shù)R2=0.9975。故細(xì)胞反應(yīng)液中GABA濃度在0～0.6g/L的范圍內(nèi)與吸光值的相關(guān)性較好。

圖6 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of GABA in Berthelot reaction

取離心后的上清液0.4mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測定其吸光度，之后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其GABA含量，結(jié)果見圖6。

如圖7所示，不同濃度的透性細(xì)胞液產(chǎn)GABA的含量不同，最初增加細(xì)胞濃度時(shí)，GABA濃度幾乎成直線上升，而隨著透性細(xì)胞濃度的繼續(xù)上升，GABA含量上升的趨勢變緩，原因可能為底物分子與酶的結(jié)合已趨于飽和。在透性細(xì)胞液濃度為6%時(shí)，測得GABA的最高含量為2.16g/L。

表2 糖發(fā)酵試驗(yàn)Table 2 Carbohydrate fermentation properties of strain

圖7 不同透性細(xì)胞濃度對GABA含量的影響Fig.7 Effect of different cell concentration on GABA content

2.5 不同培養(yǎng)基對菌體產(chǎn)GABA的影響

MRS培養(yǎng)基具有較為豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，理論上可以促進(jìn)菌體的生長，故利用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，考察其對菌體生長及GABA產(chǎn)量的影響。

將活化后的菌液按1%接種量分別接于TYG培養(yǎng)基與含10g/L底物谷氨酸鈉的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48h后，分別取發(fā)酵液進(jìn)行10倍稀釋，測其吸光度值分別為0.289與0.566。

取發(fā)酵液離心收集菌體，制作丙酮粉。將制成的TYG和MRS丙酮粉分別按6%的比例加入pH4.2～4.8的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，在1mmol/L的PLP作用下與5g/L的底物L(fēng)－Clu進(jìn)行反應(yīng)，37℃下200r/min搖床反應(yīng)20h。之后將反應(yīng)液離心，8000r/min，15min，取上清液進(jìn)行比色測定，將吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到GABA濃度分別為2.16g/L與0.122g/L。

由以上數(shù)據(jù)可以看出，MRS培養(yǎng)基可以促進(jìn)菌體的大量生長，但是GABA的含量較TYG產(chǎn)GABA的量少很多，原因可能為MRS培養(yǎng)基中某種物質(zhì)抑制了GAD酶的活性，使其不能將底物轉(zhuǎn)化為GABA，故MRS培養(yǎng)基不適用于LpL328的培養(yǎng)，在以后的實(shí)驗(yàn)中還是采用TYG培養(yǎng)基。

2.6 輔酶對GABA含量的影響

VB6是一種含吡哆醇或吡哆醛或吡哆胺的B族維生素，是某些輔酶的組成成分。PLP為磷酸吡哆醛，是GAD的輔酶，能夠促進(jìn)底物轉(zhuǎn)化為GABA；而目前市面中的VB6主要成分為鹽酸吡哆辛，也可以作為某些轉(zhuǎn)氨酶的輔酶，本實(shí)驗(yàn)采用等量VB6替代PLP，考察其作用，其他反應(yīng)條件均相同。取各試樣上清液進(jìn)行比色測定，得到吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到GABA濃度分別為：含有PLP試樣為2.16g/L，不含有PLP試樣為0.612g/L，VB6試樣為0.725g/L。

磷酸吡哆醛是氨基酸代謝中的轉(zhuǎn)氨酶及脫羧酶的輔酶，能促進(jìn)谷氨酸脫羧，促進(jìn)γ－氨基丁酸的生成，在同樣的用量及反應(yīng)條件下，VB6并沒有與PLP起到相同的作用，而與不加任何輔酶的樣品GABA含量相差不大，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中依然采用PLP作為輔酶，但是PLP價(jià)格較高，長期使用會增加實(shí)驗(yàn)成本，而選擇一種成本較低的輔酶替代物也是今后研究的主要內(nèi)容。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從酸菜汁中篩選到兩株乳酸菌LpL328、 ST328，通過對菌株發(fā)酵液的定性分析確定LpL328具有相對較好的產(chǎn)GABA的能力，對其進(jìn)行生理生化測定初步確定此菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），利用此菌株發(fā)酵得到的菌體細(xì)胞制作不同濃度梯度的透性細(xì)胞與底物溶液反應(yīng)，透性細(xì)胞濃度為6%時(shí)得到GABA的含量最高，為2.16g/L。另外，LpL328在TYG培養(yǎng)基中有良好的產(chǎn)GABA的能力，但是在MRS培養(yǎng)基中卻沒有，而PLP作為一種輔酶也是產(chǎn)GABA反應(yīng)中不可缺少的。

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Isolation and screening of lactobacillus strains for producing γ-amino butyric acid

HAN Xue，LIANG Jin-zhong*（College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

Two strains were isolated from pickled Chinese cabbage and then purified.Strains were numbered LpL328，ST328 and the former was proved to have a property to produce γ-amino butyric acid（GABA）. LpL328 strain was identified Lactobacillus plantarum by morphological observation and physiological and biochemical tests.The strain was inoculated into fermentation medium，then cells were collected and made into acetone powder.GABA was produced by reaction of acetone powder with substrate sodium glutamate.The content of GABA was 2.16g/L.

GABA；γ-Amino butyric acid；lactic acid bacteria；isolation and identification；fermentation

TS201.3

A

1002－0306（2012）20－0180－04

2012－08－07 *通訊聯(lián)系人

韓雪（1987－），女，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物與發(fā)酵工程。

黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃基金項(xiàng)目（2010td04）。