王 磊，劉玉雪，譚海東，劉武軍，趙宗保

（中國(guó)科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所 生物技術(shù)部，遼寧 大連 116023）

基于海泡石的細(xì)胞透性化

王 磊，劉玉雪，譚海東，劉武軍，趙宗保

（中國(guó)科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所 生物技術(shù)部，遼寧 大連 116023）

利用礦石納米材料海泡石處理大腸桿菌細(xì)胞，建立高效、可逆透性化處理方法。結(jié)果表明：海泡石和大腸桿菌BW25113細(xì)胞懸液渦旋振蕩，細(xì)胞通透性增強(qiáng)，90%以上的細(xì)胞因滲入博萊霉素致死；而在4℃修復(fù)處理過(guò)的樣品，僅23%的細(xì)胞被殺死。發(fā)現(xiàn)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）進(jìn)出透性化細(xì)胞的能力與胞內(nèi)外NAD濃度梯度正相關(guān)。該可逆透性化方法對(duì)生物催化和藥物遞送等研究具有重要價(jià)值。

細(xì)胞透性化；海泡石；博萊霉素；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；礦石納米材料

由于存在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的天然屏障，生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中許多物質(zhì)的胞內(nèi)外傳遞都受到跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率的限制。細(xì)胞透性化是指在不造成細(xì)胞裂解的情況下，改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性，使部分非透性分子能夠自由進(jìn)出細(xì)胞。細(xì)胞透性化技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)及生命科學(xué)研究中［1-2］。根據(jù)細(xì)胞能否修復(fù)，透性化分為可逆透性化及不可逆透性化。由于可逆透性化需要嚴(yán)格控制處理?xiàng)l件，通常采用不可逆透性化處理細(xì)胞，用于提高酶穩(wěn)定性及生物轉(zhuǎn)化效率［3-4］。然而，當(dāng)需要保證細(xì)胞存活率和保持生物催化劑穩(wěn)定性時(shí)，必須采用可逆透性化。電穿孔法是最常用的可逆透性化方法，由于其效率低，通常只在實(shí)驗(yàn)室用于DNA轉(zhuǎn)化及藥物治療［5］。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的化學(xué)法也能實(shí)現(xiàn)可逆透性化，用于將量子點(diǎn)、蛋白質(zhì)等納米顆?；蚍肿虞斎爰?xì)胞［6-7］。例如，采用鏈球菌溶血素O可在腫瘤細(xì)胞膜上造成直徑約35 nm的可修復(fù)小孔，允許相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)1.00×105的活性蛋白進(jìn)入細(xì)胞，加入Ca2+后約50%的細(xì)胞可修復(fù)［7］。

海泡石（分子式為H4Mg2Si3O10）是長(zhǎng)約5 μm、直徑在 10～50 nm的針狀納米礦石，遠(yuǎn)小于Escherichia coli的細(xì)胞尺寸［8］。在固體培養(yǎng)基表面涂布海泡石與細(xì)胞懸液可使細(xì)胞可逆透性化，實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化［9］，但以涂布方式進(jìn)行細(xì)胞透性化難以達(dá)到體系放大的目的。海泡石可在溶液中形成均勻的膠體狀懸濁液［10］。

本文中，筆者嘗試通過(guò)振蕩海泡石與細(xì)胞的懸濁液使細(xì)胞透性化，用博萊霉素敏感性考察透性化的效率及透性化后的細(xì)胞存活率［11］，用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）確定細(xì)胞膜的修復(fù)時(shí)間及分子通過(guò)透性化細(xì)胞膜輸送的特點(diǎn)，以建立了一種基于海泡石的高效、易于放大的細(xì)胞可逆透性化方法，對(duì)生物催化、藥物遞送研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

大腸桿菌E.coli BW25113，美國(guó)耶魯大學(xué)大腸桿菌遺傳庫(kù)存中心（Coli Genetic Stock Center）；海泡石，德國(guó) Kremer Pigmente有限公司；博萊霉素，Invitrogen公司；NAD、溶菌酶、蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；乙腈，Merck公司；其他培養(yǎng)基及生化試劑（醋酸銨、NaCl等），大連博諾生物化學(xué)試劑廠。

海泡石用磷酸緩沖液（PBS）（pH 7.5）配成50mg/mL貯液，NAD用去離子水配成0.25 mol/L貯液，博萊霉素用去離子水配成100mg/mL貯液。

LB培養(yǎng)基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L NaCl，用NaOH調(diào)pH至7.0，固體LB培養(yǎng)基加入15g/L瓊脂粉，在120℃滅菌20min備用。

1.2 透性化E.coli BW25113的制備

從平板挑E.coli BW25113單菌落接種100mL LB于37℃、200r/min搖床，培養(yǎng)至OD600為3.4。2 000g離心6min收集菌體，菌體用PBS洗2遍并懸浮于30mL PBS中使OD600為11。將菌液與0.1體積海泡石貯液在1.5mL離心管中混合，使海泡石終質(zhì)量濃度達(dá)到 5mg/mL，用美國(guó) Scientific Industries公司生產(chǎn)的Vortex-Genie 2渦旋振蕩器振蕩處理0.5min，振蕩強(qiáng)度為2 700r/min（最大功率）。

1.3 確定透性化效率及修復(fù)效率

取0.9mL的E.coli BW25113與5mg/mL海泡石混合后振蕩0.5min進(jìn)行透性化處理，立即取90 μL加入10 μL博萊霉素至終質(zhì)量濃度10mg/mL，輕柔混合，剩余的透性化細(xì)胞于30℃放置30min使細(xì)胞膜修復(fù)后，取90 μL加10 μL博萊霉素至質(zhì)量終濃度10mg/mL，輕柔混合。以不進(jìn)行透性化處理為對(duì)照組，將E.coli BW25113和5mg/mL海泡石輕柔混合，于30℃放置30min，再加入10mg/mL博萊霉素輕柔混合。以上3種樣品與博萊霉素混合后于4℃放置30min，使博萊霉素進(jìn)入細(xì)胞，用PBS稀釋105倍，取50 μL涂布LB平板，37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，只有透性化后恢復(fù)或未被透性化的細(xì)胞可以存活并形成菌落。每種樣品的實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3個(gè)平行樣的平均值。

1.4 確定透性化細(xì)胞膜的修復(fù)時(shí)間

通過(guò)檢測(cè)NAD轉(zhuǎn)運(yùn)效率隨修復(fù)時(shí)間的變化，確定透性化處理后細(xì)胞膜修復(fù)時(shí)間。取0.8mL的E.coli BW25113（OD600為11）與5mg/mL海泡石振蕩0.5min進(jìn)行透性化處理，于30℃靜置使細(xì)胞膜修復(fù)0、10、20和30min。隨后分別加入2 mmol/L的NAD輕柔混勻，以避免后續(xù)操作中由細(xì)胞透性產(chǎn)生的NAD滲漏，并于30℃靜置30min使細(xì)胞膜充分修復(fù)。靜置后立即洗滌菌體并浸提胞內(nèi)NAD。

參照文獻(xiàn)［12］的方法浸提檢測(cè)胞內(nèi) NAD。2 000g離心6min收集菌體，用0.9mL PBS洗2遍加0.8mL的1mg/mL溶菌酶，重懸，加入0.4mL氯仿振蕩1min使細(xì)胞充分裂解，16 000g離心10min，取0.7mL上層水相凍干，檢測(cè)時(shí)用0.2mL醋酸銨溶解。

使用美國(guó)Dionex公司的高壓液相色譜（HPLC）檢測(cè)NAD濃度。色譜條件：SinoChrom ODS-BP色譜柱（4.6mm×200mm，5 μm）；流動(dòng)相為 50 mmol/L醋酸銨（A）-乙腈（B）溶液（兩者體積比為95∶5），等度洗脫；UVD170U紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

1.5 NAD輸送速率與濃度梯度的關(guān)系

在E.coli BW25113懸液中加入NAD至1、2、2.5和3 mmol/L混勻，取0.8mL與5mg/mL海泡石輕柔混合，混合后振蕩0.5min進(jìn)行透性化處理，對(duì)照組與海泡石輕柔混合后不進(jìn)行振蕩處理。透性化處理樣品及對(duì)照組于30℃靜置20min后立即洗滌菌體并浸提檢測(cè)胞內(nèi)NAD，檢測(cè)方法同上。透性化處理樣品及對(duì)照組的差值為通過(guò)透性化的細(xì)胞膜進(jìn)入或滲出細(xì)胞的NAD量。

2 結(jié)果與討論

2.1 E.coli BW25113可逆透性化效率

由于透性化處理后，博萊霉素進(jìn)入細(xì)胞而殺死細(xì)胞，可根據(jù)透性化細(xì)胞在博萊霉素存在下的存活率確定透性化效率及其中可逆透性化比率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)透性化處理的E.coli BW25113樣品在博萊霉素存在下孵育30min后，細(xì)胞存活為每毫升（9.0±2.3）× 106個(gè)，而經(jīng)透性化處理后僅為每毫升（7.0±0.6）× 105個(gè)，即透性化處理使92%的細(xì)胞受到損傷，博萊霉素進(jìn)入細(xì)胞達(dá)到了致死劑量。然而，當(dāng)透性化細(xì)胞在4℃靜置30min，再用相同劑量博萊霉素混合處理，細(xì)胞存活回復(fù)到每毫升（7.6±1.8）×106個(gè)，這表明77%的透性化細(xì)胞可自動(dòng)修復(fù)。這是因?yàn)楹Ｅ菔饕ㄟ^(guò)物理作用損傷細(xì)胞膜，并且相互作用是瞬時(shí)的，不會(huì)持續(xù)破壞細(xì)胞膜的同一位置，有利于細(xì)胞自我修復(fù)。其他細(xì)胞透性化處理方法，包括表面活性劑及有機(jī)溶劑處理［4］和鏈球菌溶血素O處理［7］，透性化效率或可逆性低于本方法。

2.2 透性化細(xì)胞膜的修復(fù)時(shí)間

由于NAD不能自由透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但細(xì)胞膜受損后NAD就可能跨細(xì)胞膜流動(dòng)，所以可通過(guò)檢測(cè)NAD轉(zhuǎn)運(yùn)效率隨修復(fù)時(shí)間的變化規(guī)律確定透性化處理后細(xì)胞膜修復(fù)時(shí)間。將E.coli BW25113細(xì)胞與海泡石懸濁液透性化處理，于30℃靜置，考察NAD滲出細(xì)胞的情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知：0～20min，胞內(nèi)NAD的量由8.3 μmol/g（以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)）降到7.9 μmol/g。修復(fù) 20min后，胞內(nèi)NAD的量維持穩(wěn)定。結(jié)果表明，用海泡石透性化處理的E.coli BW25113細(xì)胞在30℃下20min內(nèi)自動(dòng)修復(fù)。

圖1 透性化細(xì)胞膜的修復(fù)時(shí)間Fig.1 Resealing course of permeabilized cell membrane

2.3 NAD轉(zhuǎn)運(yùn)與濃度梯度的關(guān)系

將透性化 E.coli BW25113細(xì)胞在不同胞外NAD含量存在下孵育，進(jìn)一步考察胞內(nèi)NAD含量變化規(guī)律，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知：當(dāng)胞外NAD含量為較低時(shí)，胞內(nèi)NAD傾向于擴(kuò)散到胞外；而當(dāng)胞外NAD含量為較高時(shí)，胞外NAD擴(kuò)散進(jìn)入到胞內(nèi)。說(shuō)明透性化處理后NAD依賴于濃度梯度跨細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)。

圖2 依賴于濃度梯度的NAD透膜現(xiàn)象Fig.2 NAD permeation dependent on concentration gradient

3 結(jié)論

基于海泡石的大腸桿菌透性化處理方法具有高效、可逆、操作簡(jiǎn)單、易放大的特點(diǎn)。由于海泡石通過(guò)物理作用損傷細(xì)胞膜，沒(méi)有種屬選擇性，預(yù)計(jì)該方法也可適用于其他微生物細(xì)胞。這種透性化處理方法將可應(yīng)用于生物催化、藥物遞送等研究中。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Sepiolite-mediated cell permeabilization

WANG Lei，LIU Yuxue，TAN Haidong，LIU Wujun，ZHAO Zongbao
（Division of Biotechnology，Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，China）

An efficient，reversible cell permeabilization method was developed by treatment of cells with sepiolite nanofibers.When the suspension of sepiolite nanofibers and Escherichia coli BW25113 cells were votexed，90%of the cells were found susceptible to bleomycin，whereas only 23%of the cells were susceptible upon proper resealing at 4℃.Nicotinamide adenosine dinucleotide（NAD）was either released or taken up by permeabilized cells，and the direction and rate of NAD diffusion were positively correlated to the concentration gradients across the cell membrane.This cell permeabilization method should be useful for biocatalysis and drug delivery.

cell permeabilization；sepiolite；bleomycin；nicotinamide adenosine dinucleotide（NAD）；mineral nanofiber

Q819

A

1672-3678（2015）02-0057-03

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.011

2014-03-11

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2012CB721103）

王 磊（1982—），男，山東濟(jì)寧人，博士研究生，研究方向：生物化工；趙宗保（聯(lián)系人），研究員，E-mail：zhaozb@dicp.ac.cn