黃 艷，劉曉寧，方 芳，徐 艷，魏榮卿，鄭 濤

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物能源研究所，江蘇 南京 211800）

分析紫杉醇與三尖杉寧堿的簡易方法

黃 艷1，劉曉寧1，方 芳1，徐 艷1，魏榮卿1，鄭 濤2

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物能源研究所，江蘇 南京 211800）

以粒徑單分散聚苯乙烯反相色譜填料為色譜柱固定相，即采用MKF-DK-RP型分析柱（300mm×7.8mm，8 μm），流動相為乙腈-水溶液，流速為1.0mL/min，檢測波長為229 nm，建立了一種分析紫杉醇與三尖杉寧堿的簡易方法。結(jié)果表明，本方法可使紫杉醇與三尖杉寧堿達到有效分離，且紫杉醇的檢測濃度在0.062 5～2.0mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9）。本方法簡單，重復(fù)性好。

聚苯乙烯反相色譜填料；紫杉醇；三尖杉寧堿

紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是一種具有抗癌生物活性的抗腫瘤藥物，屬于三環(huán)二萜類化合物。該化合物最早是 Wani等［1］從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）的樹皮中分離得到。它具有獨特的抗癌作用［2］，對卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌以及白血病、黑色素瘤等惡性腫瘤都具有良好的療效［3-4］。近年來，它已成為腫瘤治療領(lǐng)域中的熱點新藥并得到了廣泛關(guān)注，其市場需求量與日俱增［5］。

紫杉醇作為一種天然產(chǎn)物，在原料中的含量低微，平均含量約為0.015%（質(zhì)量分數(shù)）。為此，人們探索和研究了紅豆杉植物的栽培、紫杉醇的化學(xué)合成［6］、紅豆杉植物的組織和細胞培養(yǎng)［7］以及微生物發(fā)酵［8］等技術(shù)。在上述方法中，通過植物的組織和細胞培養(yǎng)或微生物發(fā)酵來獲取紫杉醇，它們耗時短、產(chǎn)量大且發(fā)酵液成分簡單、易于紫杉醇的分離提取等。但是，在從培養(yǎng)的植物細胞以及微生物發(fā)酵液中獲得紫杉醇，需涉及紫杉醇與紫杉烷類化合物的分離純化問題，尤其是與三尖杉寧堿（僅C-13側(cè)鏈末端的?；鶊F）差2個碳原子的分離，難度較大［9-12］。因此，開發(fā)出一種高效、快捷、經(jīng)濟、實用的提取純化方法，對紫杉醇的產(chǎn)量和質(zhì)量有著積極的意義。

針對紫杉醇與三尖杉寧堿類紫杉烷類化合物的分析分離，國內(nèi)外雖有相關(guān)報道，但大多數(shù)都采用的是以硅膠［13-15］基質(zhì)為色譜柱的高效液相色譜法（HPLC），而硅膠的不可逆吸附使樣品損失較大，且硅膠固定相只能使用一次，操作不便，價格昂貴。劉開錄等［16］報道了一種用多孔型聚苯乙烯-二乙烯基苯高分子微球作固定相反相分離純化紫杉醇的工藝，即先將紫杉烷類化合物富集在固體吸附劑上，再使用有機溶劑的水溶液進行洗脫，分步收集餾分，濃縮后再次進行柱分離。該工藝雖克服了正相色譜法中硅膠填料對樣品的不可逆吸附而造成的回收率低以及柱壽命短等缺點，但該方法工藝過程繁瑣，且分離條件未進行優(yōu)化。

本研究中，筆者選用粒徑均勻且耐壓、耐酸堿的聚苯乙烯大孔吸附樹脂填料裝填的色譜柱，對含有三尖杉寧堿和紫杉醇的發(fā)酵液進行洗脫條件優(yōu)化及分離純化后的紫杉醇進行定量分析，并考察各流動相條件對分析效果的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：美國戴安高效液相色譜系統(tǒng)，配備P680 HPLC泵、UVD-170U可變波長紫外檢測器，AT-330柱溫箱、8125型進樣裝置；MKFDK-RP型色譜柱（300mm×7.8mm，8 μm，南京麥科菲高效分離載體有限公司）。

發(fā)酵液（紫杉醇含量為33.3%、三尖杉寧堿含量為39.2%（以質(zhì)量分數(shù)計）），南京麥科菲高效分離載體有限公司；紫杉醇標準品（純度為93.7%）、三尖杉寧堿標準品（純度為82.6%）、甲醇、乙腈（色譜純），美國TEDIA公司；乙醇（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；超純水，自制。

1.2 溶液的配制

標準品儲備液 精密稱取20.0mg紫杉醇和三尖杉寧堿標準品置于10mL容量瓶中，用甲醇溶液定容。得到2.0mg/mL的紫杉醇和三尖杉寧堿標準品混合液，用甲醇溶液分別稀釋成濃度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125和0.062 5mg/mL的一系列的標準工作溶液，繪制標準曲線。

供試品-1 移取發(fā)酵液0.5mL至20mL的容量瓶中，以甲醇溶液定容至20mL，用0.45 μm的有機濾膜過濾，待測（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

供試品-2 精密稱取三尖杉寧堿標準品10mg，以甲醇溶液定容至10mL，用0.45 μm的有機濾膜過濾，待測（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

供試品-3 精密稱取紫杉醇標準品10mg，以甲醇溶液定容至10mL，用0.45 μm的有機濾膜過濾，待測（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.3 色譜條件

流動相為A（超純水）、B（乙醇）、C（乙腈），流速為1.0mL/min，進樣量為20 μL，檢測溫度為室溫；檢測波長為229 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

以供試品-1為研究對象，考察流動相種類及比例對紫杉醇和三尖杉寧堿分離純化的影響。由文獻可知，可用甲醇-水［17］、乙醇-水［18］或乙腈-水［19］體系對紫杉醇與三尖杉寧堿進行色譜分析。筆者分別對該3種流動相體系作了系統(tǒng)適應(yīng)性實驗，有機相濃度均為60%，結(jié)果見圖1。

圖1 不同流動相體系下樣品的高效液相色譜圖Fig.1 The test sample under different mobile phase systems by chromatograms of HPLC

由圖1可知：甲醇-水作為洗脫溶劑，樣品在60min還未出峰；乙醇-水體系的分析周期約為60min，分離度為1.26；乙腈-水體系的分析周期最短（25min），且分離度最好（1.67）。目前，文獻中多以硅膠C18［20-22］分離純化紫杉醇與三尖杉寧堿，但其分離度僅以1.2為標準來衡量。

采用該乙腈-水色譜條件，用紫杉醇和三尖杉寧堿的標準品對照定性，并對紫杉醇和三尖杉寧堿進行檢測。供試品-1、供試品-2（三尖杉寧堿標準品）和供試品-3（紫杉醇標準品）的液相色譜圖見圖2。

圖2 供試品-1至-3樣品的高效液相色譜Fig.2 The test samples of 1-3 by chromatograms of HPLC

由圖2可知，在該色譜洗脫條件下，三尖杉寧堿和紫杉醇的保留時間分別為19.64min和22.34min。與藥典中的檢測方法相比，藥典中采用梯度洗脫法，不僅洗脫程序復(fù)雜，且三尖杉寧堿和紫杉醇的保留時間分別為25.64min和27.44min，分析周期長且分離度（1.46）差。故乙腈-水色譜條件可用于后文紫杉醇純品的檢測。

2.2 標準曲線和線性范圍

精密吸取不同質(zhì)量濃度（2.0、1.0、0.5、0.25、0.125和0.062 5mg/mL）的紫杉醇和三尖杉寧堿溶液，采用2.1節(jié)乙腈-水色譜條件，進行檢測。以紫杉醇和三尖杉寧堿的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制紫杉醇和三尖杉寧堿的標準曲線并進行線性回歸計算，得到回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。由表1可知，紫杉醇和三尖杉寧堿標準品在0.062 5～2.0mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表1 紫杉醇和三尖杉寧堿的線性范圍、回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear ranges，regression equation and correlation coefficient of paxlitaxel and cephalom

2.3 樣品在乙腈-水體系中的洗脫規(guī)律探討

以乙腈-水為流動相，對紫杉醇和三尖杉寧堿混合樣進行色譜分析，通過改變流動相中有機相與水的比例實現(xiàn)紫杉醇與三尖杉寧堿的有效分離，并探索其中流動相與2種物質(zhì)洗脫速率和分離度的規(guī)律。

2.3.1 乙腈洗脫濃度范圍的確定

分別以40%、45%、55%和60%（乙腈體積分數(shù)）的乙腈-水為流動相，對供試品-1進行等度洗脫。由結(jié)果可知，在40%～60%乙腈濃度范圍內(nèi)，供試品-1都能被洗脫出來，說明該濃度范圍的乙腈-水體系流動相能實現(xiàn)紫杉醇和三尖杉寧堿的洗脫；隨著洗脫溶液中乙腈的含量增加，樣品出峰趨快，分離度卻變差，不能達到物質(zhì)分離要求。因此，僅依賴于等度洗脫尚不能實現(xiàn)紫杉醇和三尖杉寧堿的有效分離。為此，接下來在40%～60%乙腈濃度范圍內(nèi)進行梯度洗脫優(yōu)化，以期實現(xiàn)紫杉醇與三尖杉寧堿的更佳分離。

2.3.2 乙腈梯度洗脫條件優(yōu)化

采用分段梯度洗脫法，分別對各階段的洗脫時間和濃度進行優(yōu)化，以實現(xiàn)紫杉醇與三尖杉寧堿的有效分離。將分離條件模式分為“前段”，即前段高濃度將樣品較快地沖入色譜柱內(nèi)；“中段”，即中段低濃度以延遲紫杉醇的出峰時間，提高分離度；“后段”，即后段高濃度將紫杉醇快速洗脫出來，以縮短分析周期。樣品洗脫結(jié)果見圖3和表2。

圖3 乙腈梯度洗脫條件下的高效液相色譜Fig.3 HPLC chromatograms of sample

由梯度洗脫條件1和2比較可知，前段的洗脫條件相同，延長梯度變化（60%～50%）洗脫時間，條件1比2出峰時間晚，說明流動相洗脫濃度越低，出峰時間越晚；條件1和2中紫杉醇出峰時間相差不大，但條件1中的三尖杉寧堿出峰較晚，說明前段的乙腈洗脫濃度主要影響三尖杉寧堿的出峰時間；與條件1相比，條件2中的40%乙腈等度洗脫時間長，分離度得到改善，但三尖杉寧堿峰型拖尾嚴重，說明中段40%乙腈洗脫時間不宜過長。由梯度洗脫條件1和3比較可知，延長前段（3～5min）洗脫時間，條件3的梯度條件變化簡單，即采用24min將乙腈濃度由45%升至60%的線性洗脫，出峰時間提前，分離度提高，說明中段洗脫采用線性梯度洗脫更有利于紫杉醇和三尖杉寧堿的分離。由梯度洗脫條件3和4比較可知，前段洗脫條件相同，而條件4中的線性洗脫，乙腈濃度由40%升至60%，出峰時間稍晚，但分離度提高，說明線性梯度洗脫，乙腈濃度由40%升至60%，能夠?qū)崿F(xiàn)紫杉醇和三尖杉寧堿的有效分離。

表2 乙腈梯度洗脫的分離參數(shù)Table 2 Separation parameters of different gradient elution of acetonitrile

2.4 紫杉醇的含量分析

收集梯度洗脫條件4下的紫杉醇峰物質(zhì)樣品（記為紫杉醇純品），將其濃縮后在2.1節(jié)乙腈-水色譜條件下進行含量分析，結(jié)果見圖4。

圖4 供試品-1和紫杉醇純品的高效液相色譜Fig.4 HPLC chromatograms of the test sample-1 and paclitaxel

由圖4可知，經(jīng)紫杉醇標準濃度曲線的定量，供試品-1中紫杉醇的純度為33.32%，純化后得到的紫杉醇純品的純度為98.65%，即除去了原料液中幾乎全部的色素和絕大部分雜質(zhì)。說明樣品經(jīng)乙腈-水流動相分段梯度洗脫后，三尖杉寧堿與紫杉醇達到了有效分離，且經(jīng)定量分析，紫杉醇的回收率可達到86%。該法可為今后紫杉醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供有力的實驗和理論依據(jù)。

3 結(jié)論

采用聚苯乙烯基質(zhì)色譜柱（MKF-DK-RP），以乙腈-水為流動相，對含有紫杉醇和三尖杉寧堿的發(fā)酵液樣品進行洗脫條件優(yōu)化并將分離純化后的紫杉醇進行含量分析。經(jīng)過對樣品的洗脫條件優(yōu)化后，采用分段梯度洗脫法，可將紫杉醇與三尖杉寧堿有效分離，且經(jīng)標準濃度曲線的定量，得到純度為98.65%的紫杉醇純品，除去了原料液中幾乎全部的色素和絕大部分雜質(zhì)，這給紫杉醇的分離純化向工業(yè)化方向發(fā)展提供了有力的理論和實驗依據(jù)，具有重要的參考價值。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Simplified analysis and purification of paclitaxel and cephalomannine

HUANG Yan1，LIU Xiaoning1，F(xiàn)ANG Fang1，XU Yan1，WEI Qongqing1，ZHENG Tao2，
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China；2.BioEnergy Institute，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

A simple analytical and purification method for paclitaxel and cephalomannine was developed using the MKF-DK-RP analytical column（300mm×7.8mm，8 μm particle size）with monodisperse polystyrene reverse-phase chromatography.The mobile phase was acetonitrile-water at a flow rate of 1.0mL/min.The detection wavelength was 229 nm.Paclitaxel and cephalomannine could be effectively purified.It could quantitatively analyze and purify paclitaxel in the range between 0.062 5 and 2.0mg/mL（r=0.999 9）.The optimized process is easy to operate，and reproducible.

polystyrene reverse-phase chromatography packing；Paclitaxel；Cephalomannine

O652.63

A

1672-3678（2015）02-0081-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.016

2013-12-10

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2013CB733504）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2012AA021203）

黃 艷（1987—），女，江蘇灌南人，碩士研究生，研究方向：生物化工；鄭 濤（聯(lián)系人），教授，E-mail：hellozheng@gmail.com