吳 潔，陳曉娣，鄧 蕓，朱 凱，韓萍芳，顧 軍

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京大學(xué)昆山創(chuàng)新研究院，江蘇 昆山 215347；3.南京大學(xué) 物理學(xué)院，江蘇 南京 210093）

咪唑離子液體對四尾柵藻的毒性

吳 潔1，2，陳曉娣1，2，鄧 蕓2，3，朱 凱2，3，韓萍芳1，顧 軍2，3

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京大學(xué)昆山創(chuàng)新研究院，江蘇 昆山 215347；3.南京大學(xué) 物理學(xué)院，江蘇 南京 210093）

按照藻類生長抑制試驗標(biāo)準(zhǔn)方法，以四尾柵藻為受試生物，研究了離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（［C4mim］［Cl］）和1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（［C4mim］［BF4］）對四尾柵藻的影響，測定了半數(shù)有效濃度（EC50）和葉綠素含量。結(jié)果表明：［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］對四尾柵藻的生長和葉綠素的產(chǎn)生均具有抑制作用，毒性效應(yīng)隨著濃度的增大和培養(yǎng)時間的增長而增加，96 h的EC50分別為57.8和38.8mg/L。離子液體質(zhì)量濃度為200mg/L時，四尾柵藻的葉綠素總量僅為對照組的32%和26%。此結(jié)果可以說明離子液體對生態(tài)系統(tǒng)存在潛在的負(fù)面效應(yīng)。

四尾柵藻；離子液體；毒性；半數(shù)有效濃度EC50；葉綠素含量

離子液體是一類完全由離子組成的有機鹽，熔點低于100℃［1］，通常由體積相對較大且結(jié)構(gòu)不對稱的有機陽離子和體積較小的無機或有機陰離子組成［2-4］。離子液體沒有明顯的蒸氣壓，可以減少對大氣的污染和對操作人員的危害，因而被稱為是“綠色溶劑”［5］，在生物催化、合成化學(xué)、電化學(xué)領(lǐng)域和分析領(lǐng)域，如分離、提取、電解、傳感和光譜測定，都有廣泛的應(yīng)用前景。

隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到離子液體雖然被稱為“綠色溶劑”，但實際上存在許多“綠色問題”［6］。有文獻指出離子液體對生物，如細菌、藻類、植物、魚類和動物等都有一定的毒性［7］。而且考慮到離子液體具有良好的化學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定性，離子液體一旦被排放或意外泄漏到環(huán)境中，就有可能成為一種新的持久性污染物而長期存在水和土壤中，從而污染環(huán)境［8］。

由于某些離子液體較好的水溶性［9］，其對水環(huán)境的影響不容忽視［7］。目前，離子液體對大型蚤、斑馬魚、蚯蚓和鹵蟲等的毒性研究已有很多報道［10-14］，而關(guān)于咪唑離子液體對藻類的毒性研究的國內(nèi)報道還較少。藻類是整個生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要基礎(chǔ)，其本身的生長和代謝會直接受到污染物的影響，進而影響到初級消費者及高級消費者的正常生長和生理代謝過程。藻類對許多毒物的敏感性要超過魚類或甲殼類，而且藻類具有生長周期短、易培養(yǎng)［15］、可直接觀察細胞水平上的毒性癥狀等特點；同時藻類的生物測定與其他生物的測定方法相比，相對簡單、快速［16］。四尾柵藻是一種常見的淡水藻，易在實驗室培養(yǎng)，且對外界環(huán)境變化敏感，因此在毒理學(xué)研究中常作為指示生物［17］。

本文中，筆者按照藻類生長抑制實驗，進行了2種咪唑類離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（［C4mim］［Cl］）和1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（［C4mim］［BF4］）對四尾柵藻的毒性試驗，測定生長速率和葉綠素含量，比較兩種陰離子對微藻的毒性的影響，以期為完善該類物質(zhì)的環(huán)境影響評估提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 生物材料

四尾柵藻（Scenedesmus quadricauda，F(xiàn)ACHB-1297）購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫。將藻種接種至滅菌的BG11培養(yǎng)基（BG11配方由中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫提供）中，于人工氣候室內(nèi)的搖床上進行培養(yǎng)和擴大繁殖，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照為2 500 lx，光暗比為12 h∶12 h，搖床的搖速設(shè)定為120r/min。

BG11培養(yǎng)液配方（1 L）：NaNO31.5g、K2HPO40.04g、MgSO4·7H2O 0.075g、CaCl2·2H2O 0.036g、檸檬酸 0.006g、檸檬酸鐵銨 0.006g、EDTANa20.001g、Na2CO30.02g、A5微量溶液1mL。

A5微量溶液配方（1 L）：H3BO32.86g、MnCl2· 4H2O 1.86g、ZnSO4·7H2O 0.22g、CuSO4·5H2O 0.08g、Co（NO3）2·6H2O 0.05g。

1.2 受試離子液體

1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（［C4mim］［Cl］）和1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（［C4mim］［BF4］）均購于上海成捷化學(xué)有限公司，1H NMR測試純度大于99%。

1.3 實驗方法

實驗方法按照國家環(huán)保局“化學(xué)品測試方法”中的藻類生長抑制實驗［18］進行。離子液體的試驗濃度為20、50、100和200mg/L，每個濃度設(shè)3個平行。所用玻璃器皿和培養(yǎng)液均經(jīng)過 0.1 MPa、121℃、25min滅菌。實驗所用容器為250mL錐形瓶，培養(yǎng)量100mL。取對數(shù)生長期的藻液進行接種，初始光密度OD680＞0.1。每天定時測四尾柵藻的光密度，并取樣測其葉綠素。

1.4 分析測定方法

1.4.1 半最大效應(yīng)濃度（EC50值）

用紫外可見分光光度計在680 nm處測定藻液的光密度（OD680）表示四尾柵藻的生長，并用血球計數(shù)板進行計數(shù)，建立光密度和細胞數(shù)之間的關(guān)系。根據(jù)μ=（ln Nt-ln N0）/（t-t0）計算四尾柵藻的生長速率μ，N0為試驗開始時（t0）的藻密度；Nt為試驗開始后（t）時間的藻密度；而生長抑制率 B=［（μbμtox）/μb］×100%，μb為對照組的生長速度，μtox為試驗組的生長速度。采用概率單位法［19］計算EC50，即通過查表，先將計算出的生長速率換算成概率單位，然后將離子液體的濃度對數(shù)與概率單位進行一元線性回歸，得到離子液體-四尾柵藻的劑量-反應(yīng)方程，當(dāng)概率單位為5時，通過回歸方程計算EC50。

1.4.2 藻類葉綠素含量

根據(jù)《水和廢水監(jiān)測分析方法》［20］中葉綠素的測定方法，并加以改進。取一定量的藻液進行離心，棄上清液，在沉淀中加入2～3mL 90%丙酮，用組織研磨器充分研磨后，4 000r/min離心10min，上清液倒入10mL具塞試管中。再用2～3mL 90%（體積分?jǐn)?shù)）丙酮繼續(xù)研磨提取葉綠素。離心后，上清液再轉(zhuǎn)入10mL具塞試管中。重復(fù)以上操作1～2次，用90%丙酮定容至10mL，搖勻，最后，將上清液在分光光度計上，用1cm光程的比色皿，以90%丙酮作為空白進行校零，分別測定663和645 nm波長下的吸光度OD663和OD645。

根據(jù)文獻［21］計算葉綠素含量見式（1）～式（3）。

式中：ρa（Chl a）為葉綠素a的質(zhì)量濃度，mg/L；ρb為葉綠素b（Chl b）的質(zhì)量濃度，mg/L；ρT為總的葉綠素質(zhì)量濃度，mg/L。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007處理后，使用Origin 8.1作圖；使用 SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 毒性效應(yīng)曲線

圖1為［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］咪唑離子液體在不同濃度條件下對四尾柵藻生長的影響曲線。

圖1 離子液體對四尾柵藻生長影響曲線Fig.1 Effects of ionic liquids on growth of S.quadricauda

由圖1可知：離子液體對四尾柵藻生長的抑制作用隨濃度的增加而增強，與對照組相比，不同試驗濃度下的四尾柵藻在測試時間內(nèi)的生長均受到抑制，各個濃度下的四尾柵藻在2 d內(nèi)長勢較慢，但隨著時間的延長，長勢開始出現(xiàn)差異：低濃度下（20mg/L和50mg/L）的藻雖受影響但仍然緩慢生長；高濃度的離子液體對藻的抑制作用較強，因而藻的生長趨勢趨于平緩，有下降趨勢。

2.2 EC50值測定結(jié)果

通過概率單位法計算得到的離子液體對四尾柵藻的各時間下的劑量-反應(yīng)方程和EC50，結(jié)果見表1。

表1 ILs對四尾柵藻的劑量-反應(yīng)方程Table 1 The line dose-response equation for S.quadricauda

由表1可知：各時間的劑量-反應(yīng)方程的線性相關(guān)性均良好。在試驗期間內(nèi)，［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］的 EC50值從369.4和231.2mg/L（24 h）分別減小到57.8和38.8mg/L（96 h），抑制作用隨著時間的延長而增強。根據(jù)藻類生長抑制的急性毒性標(biāo)準(zhǔn)［22］進行分級，96 h的EC50均大于10mg/L 且小于 100mg/L，［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］對四尾柵藻的毒性屬于級別3。

圖2 離子液體對四尾柵藻的葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of ionic liquids on chlorophyll content of S.quadricauda

2.3 離子液體對四尾柵藻葉綠素含量的影響

圖2表示2種離子液體處理四尾柵藻96 h后的葉綠素總量的變化。由圖2可知：在試驗濃度范圍，2種離子液體對四尾柵藻葉綠素的產(chǎn)生均有較強的抑制作用。隨著離子液體濃度的增強，葉綠素總量逐漸減小，［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］質(zhì)量濃度為200mg/L時，四尾柵藻的葉綠素總量僅為對照組的32%和26%。

而2種離子液體處理四尾柵藻96 h后的葉綠素a和葉綠素b的變化如表2所示。由表2可知：隨著離子液體的濃度增加，四尾柵藻的葉綠素a和葉綠素b的含量總體呈下降趨勢。各濃度下的四尾柵藻的葉綠素a和葉綠素b的含量與對照組相比，差異都達到了顯著性水平（p＜0.05），說明離子液體對藻的葉綠素的影響極顯著。離子液體濃度的升高導(dǎo)致了藻細胞生長受到抑制，葉綠素含量逐漸減少。這可能是因為離子液體透過四尾柵藻的細胞壁，結(jié)合在磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)表面［23］，破壞了膜蛋白的結(jié)構(gòu)［24］和葉綠體結(jié)構(gòu)的完整性［25］，從而影響了葉綠素的合成。段煉等［26］通過觀察藻細胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，離子液體的加入會破壞藻細胞葉綠體的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致葉綠體片層結(jié)構(gòu)斷裂，從而使葉綠素合成受阻，藻細胞內(nèi)葉綠素含量減少。

表2 離子液體處理96 h后四尾柵藻的葉綠素a和b含量Table 2 The chlorophyll a and chlorophyll b content of S.quadricauda after 96 h ionic liquids exposure

綜合圖2和表2可以看出，［C4mim］［BF4］比［C4mim］［Cl］對四尾柵藻的毒性大。相同陽離子的離子液體，毒性差異主要是陰離子的影響，因而陰離子［BF4］-的毒性比［Cl］-的強，這與Cho等［16］的研究結(jié)果一致。這可能是因為［BF4］-水解后產(chǎn)生了F-，導(dǎo)致其毒性增大，Phuong等［15］用離子色譜法證實了F-的存在。而且F-是位于細胞表面的Na+_K+_ATP酶的抑制劑，會干擾細胞基本的自我修復(fù)過程［27］，但具體機制還不清楚。

2.4 離子液體對四尾柵藻細胞形態(tài)的影響

圖3為不同濃度離子液體處理藻細胞后，細胞形態(tài)變化的照片。由圖 3可知：含有低濃度（20mg/L）離子液體的藻液，出現(xiàn)柵藻細胞膨脹和破碎的時間晚，且膨脹和破碎的藻細胞少，藻液顏色與未含離子液體的藻液相比，顏色偏黃；而隨著離子液體濃度的增加，破碎和膨脹的藻細胞逐漸增多，當(dāng)離子液體質(zhì)量濃度為200mg/L時，出現(xiàn)大量細胞空殼，藻液顏色發(fā)白。

這是因為咪唑離子液體的陽離子結(jié)構(gòu)與陽離子表面活性劑相似［15，26］，一端是親水的咪唑基團，一端是親油的烷基鏈。表面活性劑對藻細胞的作用主要是其吸附在磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)表面，引起膜脂結(jié)構(gòu)的破壞及其功能的喪失［28］。離子液體對藻細胞的影響與表面活性劑的影響類似：離子液體透過藻細胞的細胞壁，結(jié)合到膜脂結(jié)構(gòu)表面，影響了細胞膜的正常功能，導(dǎo)致細胞畸形生長，出現(xiàn)了膨脹現(xiàn)象［23］，當(dāng)細胞膨脹到一定程度，則有可能撐破細胞壁束縛而破碎。

圖3 離子液體處理96 h后的藻細胞形態(tài)的影響Fig.3 The cell morphology change of S.quadricauda after different concentration ionic liquids exposure

3 結(jié)論

研究［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］離子液體對四尾柵藻的毒性效應(yīng)，［C4mim］［BF4］比［C4mim］［Cl］對四尾柵藻的毒性大，且毒性隨著時間的延長而增強。具體表現(xiàn)為 EC50值逐漸減?。海跜4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］的EC50分別從369.4mg/L和231.2mg/L（24 h）減小到57.8mg/L和38.8mg/L（96 h）。加入［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］后處理96 h，對應(yīng)的EC50值均大于10mg/L且小于100mg/L，根據(jù)藻類生長抑制的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，對四尾柵藻的毒性屬于級別3。

在0～200mg/L范圍內(nèi)，離子液體［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］對四尾柵藻生長的抑制作用隨濃度的增加而增強，葉綠素含量也隨之下降。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Toxicity of imidazolium-based ionic liquids to Scenedesmus quadricauda

WU Jie1，2，CHEN Xiaodi1，2，DENG Yun2，3，ZHU Kai2，3，HAN Pingfang1，GU Jun2，3
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China；
2.Kunshan Innovation Institute of Nanjing University，Kunshan 215347，China；3.School of Physics，Nanjing University，Nanjing 210093，China）

Toxic effects of ionic liquids 1-butyl-3-methylimidazolium chloride（［C4mim］［Cl］）and 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate（［C4mim］［BF4］）on Scenedesmus quadricauda were studied by using alga growth inhibition test.Two endpoints EC50values and chlorophyll contents were determined. The results indicate that［C4mim］［Cl］and［C4mim］［BF4］limited the growth and chlorophyll content of S.quadricauda，the toxic effects increased with the concentration and incubation time.The 96 h EC50was 57.8 and 38.8mg/L，respectively.When adding 200mg/L ionic liquid，the total chlorophyll content of S.quadricauda were only 32%and 26%respectively，compared with the control group.Our findings imply the potential adverse effect of ionic liquids on the ecological system.

Scenedesmus quadricauda；ionic liquids；toxicity；EC50；chlorophyll content

Q93

A

1672-3678（2015）02-0076-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.015

2013-08-13

江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012218）

吳 潔（1989—），女，江蘇常州人，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)；韓萍芳（聯(lián)系人），教授，E-mail：hpf@njtech.edu.cn