馮玲然，王 強(qiáng)，羅 瑋，余曉斌

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

普洱茶中功能性微生物的篩選及其對普洱茶感官品質(zhì)的影響

馮玲然，王 強(qiáng)，羅 瑋，余曉斌

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

普洱茶的渥堆發(fā)酵過程是以曬青毛茶的內(nèi)含成分為基礎(chǔ)，在微生物分泌的胞外酶及濕熱作用下，發(fā)生一系列化學(xué)變化，最終形成普洱茶獨(dú)特的風(fēng)味。采用稀釋涂布法，根據(jù)產(chǎn)酶微生物的特性，經(jīng)過固體平板初篩和液體茶湯培養(yǎng)基復(fù)篩，從普洱茶中分離得到若干株產(chǎn)酶菌株，并從中挑選優(yōu)良菌株接種普洱茶固體發(fā)酵，考察其對普洱茶感官品質(zhì)的影響。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，D13-16為米曲霉（Aspergillus oryzae），相似度為98.62%；GJ-02為米根霉（Rhizopus cryzae），相似度為98.57%；XW-10和DF-03均為黑曲霉（Aspergillus niger），相似度分別為99.10%和99.92%。結(jié)果表明：普洱茶香氣的形成主要與蛋白酶產(chǎn)生菌有關(guān)，DB-16發(fā)酵后香氣評分達(dá)到31分（對照28，總分40）；湯色主要受多酚氧化酶產(chǎn)生菌的影響，DF-03發(fā)酵后湯色評分達(dá)到19分（對照12，總分20）；而這四種功能性微生物均在不同程度上促進(jìn)了普洱茶滋味的形成。

普洱茶；篩選；微生物；酶；感官品質(zhì)

普洱茶是以中國云南大葉種茶樹的鮮葉經(jīng)過殺青、揉捻、干燥等工藝程序制備而成的曬青毛茶為原料，再經(jīng)過渥堆發(fā)酵而成的散茶和緊壓茶。如今普洱茶生產(chǎn)工藝將古代制法的曬青和現(xiàn)代制法的渥堆發(fā)酵結(jié)合，賦予其更獨(dú)特的風(fēng)味。普洱茶在發(fā)酵過程中的功能性微生物與其陳香、醇厚、甘甜、絲滑等風(fēng)味品質(zhì)特點(diǎn)是分不開的［1-2］。微生物分泌的胞外酶（如多酚氧化酶、纖維素酶、果膠酶和蛋白酶等）催化普洱茶生茶中茶多酚的氧化縮合、蛋白質(zhì)的降解、碳水化合物的分解以及各產(chǎn)物之間的聚合等一系列復(fù)雜反應(yīng)［3-4］。在發(fā)酵過程中，大分子碳水化合物被分解為小分子的糖及可溶性糖，可溶性糖是構(gòu)成普洱茶湯滋味和黏稠度的重要物質(zhì)之一，同時(shí)也是在感官上表現(xiàn)出的所謂“甘甜”。茶葉中所含蛋白質(zhì)約占干物質(zhì)量的20%～30%，經(jīng)過加工工藝分解為多種氨基酸，賦予普洱茶湯“醇厚”及新鮮的口感。芳香物質(zhì)及糖類等，經(jīng)過復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生萜烯醇類等化合物，表現(xiàn)出了普洱茶特有的“陳香”風(fēng)味。茶多酚在茶葉中是最具有特征性的物質(zhì)，經(jīng)發(fā)酵過程氧化分解為各種茶色素，賦予了普洱茶茶湯獨(dú)特古樸的紅褐底色［5-6］。

普洱茶的品質(zhì)成分主要是在渥堆發(fā)酵過程中形成。如粗纖維、蛋白質(zhì)、茶多酚和果膠等在微生物分泌的胞外酶和濕熱條件的協(xié)調(diào)作用下，發(fā)生了氧化、聚合、降解、分解和轉(zhuǎn)化反應(yīng)，鮮、醇、甜、酸、澀、苦等風(fēng)味物質(zhì)綜合調(diào)和，形成了普洱茶陳醇微澀的獨(dú)特口感［7］。因此，考察普洱茶中的產(chǎn)酶功能性微生物對普洱茶品質(zhì)成分的影響具有重要意義。

本研究中，筆者從普洱熟茶中篩選得到產(chǎn)多酚氧化酶、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶的微生物，并將其接種普洱茶固體發(fā)酵，考察不同功能性微生物對普洱茶感官品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

所用曬青毛茶、普洱熟茶均由云南中茶茶葉有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

奶粉培養(yǎng)基 牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，瓊脂25g，脫脂奶粉10g，水1 000mL。pH 7.0～7.2。

果膠培養(yǎng)基 果膠1g，蔗糖20g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，F(xiàn)e2（SO4）30.01g，K2HPO41g，NaNO33g，瓊脂25g，水1 000mL。pH自然。

剛果紅纖維素培養(yǎng)基 羥甲基纖維素鈉（CMCNa）10g，（NH4）2SO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO41g，NaCl 0.5g，剛果紅0.2g，瓊脂25g，水1 000mL。pH自然。

茶葉瓊脂培養(yǎng)基 曬青毛茶30g，水1 000mL，煮沸5min，紗布過濾去除茶渣，瓊脂20g。pH 6.0，121℃滅菌20min。

液體茶湯培養(yǎng)基 曬青毛茶粉碎，按固液化1∶25g/mL加水混合，煮沸10min，250mL三角瓶裝液50mL，pH 6.0，110℃滅菌20min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基 按m（曬青毛茶）∶m（水）= 5∶2的比例混合，充分混合后分裝250mL三角瓶，每瓶20g。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選

稱取普洱茶熟茶1g，加入99mL無菌生理鹽水中，浸泡10min，采用稀釋涂布法，將茶葉水稀釋至10-3、10-4、10-5梯度，分別取100 μL涂布于奶粉培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)4～5 d，觀察各個(gè)菌株的生長狀況，若在菌落周圍出現(xiàn)透明的水解圈，則表明該菌具有產(chǎn)生蛋白酶的能力。

1.3.2 果膠酶產(chǎn)生菌的篩選

稀釋涂布于果膠培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)4～5 d，后加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1.0%十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，多糖沉淀劑），靜置10min，若在菌落周圍出現(xiàn)透明圈，則表明該菌具有產(chǎn)生果膠酶的能力。

1.3.3 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選

稀釋涂布于剛果紅纖維素培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)6～7 d，觀察各個(gè)菌株的生長狀況，若在菌落周圍出現(xiàn)透明圈或者菌落菌絲變紅，則表明該菌具有產(chǎn)生纖維素酶的能力。

1.3.4 多酚氧化酶產(chǎn)生菌的篩選

稀釋涂布于茶葉瓊脂培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)4～5 d，觀察各個(gè)菌株的生長狀況，若有褐色素產(chǎn)生，則表明該菌具有產(chǎn)生多酚氧化酶的能力。

1.3.5 游離氨基酸的測定

游離氨基酸的測定采用茚三酮比色法［8］。

1.3.6 水溶性果膠的測定

水溶性果膠的測定采用沉淀法［9］。

1.3.7 粗纖維和茶多酚的測定

粗纖維和茶多酚的測定參考文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。

1.3.8 液體茶湯發(fā)酵條件

由于普洱茶固體發(fā)酵周期較長，為提高篩選效率，復(fù)篩采用液體茶湯發(fā)酵。將平板初篩菌種接入液體茶湯培養(yǎng)基中，37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)4～5 d。

1.3.9 固體發(fā)酵條件

將復(fù)篩得到的優(yōu)良菌株接種固體發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、濕度80%的條件下培養(yǎng)40 d，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行感官評審。

1.3.10 普洱茶內(nèi)質(zhì)感官評審方法

普洱茶感官評定的具體描述、評價(jià)和記錄參考云南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 53/T 103—2006普洱茶，本研究僅對普洱茶的內(nèi)質(zhì)進(jìn)行感官評審。普洱茶內(nèi)質(zhì)的各指標(biāo)權(quán)數(shù)為：香氣40%、滋味40%、湯色20%、葉底20%，總分100分。根據(jù)各指標(biāo)的等級和權(quán)數(shù)評分，具體特征等級見表1。

1.3.11 菌種鑒定

基因組提取 按照上海生工生物工程有限公司的SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系 50 μL的總反應(yīng)體積中包含1 μL DNA模板，每個(gè)引物0.5 μL（10 μmol/L），0.5 μL dNTP Mixture（10 mmol/L），2.5 μL 10×Taq reaction Buffer，加水至25 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8min。18s rDNA測序引物序列：NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’；NS6：5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’NS5：5’-GTTTCTAGGACCGCCGTA-3’（中間引物，用于測序）。PCR產(chǎn)物經(jīng)l%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外成像系統(tǒng)拍照。由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果切割所需DNA目的條帶純化，具體操作步驟見說明書。將純化后的PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。測定的18S rDNA序列用Blastn工具與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行相似性比較分析。

表1 普洱散茶（熟茶）感官品質(zhì)特征Table 1 Sensory quality characteristic of Pu-erh loose tea（ripe tea）

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選

蛋白酶可催化普洱茶中蛋白質(zhì)水解形成氨基酸，能改善普洱茶的鮮爽度和香氣，提高茶湯質(zhì)量。本研究利用奶粉培養(yǎng)基從熟茶茶樣中篩選出若干株蛋白酶產(chǎn)生菌，根據(jù)菌落周圍透明圈大小，挑選出DB-07、DB-08、DB-13、DB-16和DB-20這5株較優(yōu)菌株做進(jìn)一步液體茶湯發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。由圖1可知：游離氨基酸的含量明顯上升，其中菌株DB-16效果最佳。根據(jù)文獻(xiàn)［5，11］報(bào)道，在普洱茶發(fā)酵過程中，蛋白酶的作用并不能使游離氨基酸的含量升高，熟茶中游離氨基酸含量反而比生茶中的含量低。這是由于在普洱茶固體發(fā)酵過程中，氨基酸發(fā)生氧化分解和轉(zhuǎn)化，形成香氣物質(zhì)，并且能夠與茶多酚的氧化分解產(chǎn)物結(jié)合形成茶褐素等物質(zhì)。而在液體茶湯發(fā)酵過程中，菌種單一，氨基酸很少發(fā)生分解和轉(zhuǎn)化，而且已測試這幾株菌株不分泌多酚氧化酶。所以，在微生物分泌的蛋白酶催化作用下，茶湯中游離氨基酸含量明顯上升。

圖1 初篩菌株對游離氨酸含量的影響Fig.1 Effects of different strains on free amino acids content

2.2 果膠酶產(chǎn)生菌的篩選

從果膠培養(yǎng)基上挑選出GJ-02、GJ-08、GJ-09、GJ-13和GJ-17這5株透明圈/菌落直徑比例大的菌株做進(jìn)一步復(fù)篩試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。由圖2可知：發(fā)酵結(jié)束后，水溶性果膠含量明顯升高，其中接種菌株GJ-02的實(shí)驗(yàn)組比對照提升了近4倍。在茶葉加工過程中，鮮葉中的原果膠在果膠酶的作用下水解成水溶性果膠和阿拉伯糖、半乳糖等物質(zhì)參與滋味品質(zhì)的形成。水溶性果膠是茶湯具有味厚感和增加茶湯濃稠度并使茶湯甘醇的主要物質(zhì)，其含量變化影響普洱茶的品質(zhì)［12］。在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中，原果膠和水溶性果膠成波動(dòng)變化，但總體趨勢是原果膠減少而水溶性果膠增加［12-13］，本文的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

2.3 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選

根據(jù)剛果紅染色后形成的水解圈直徑和菌落直徑的比值，挑選產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的菌株XW-01、XW-02、XW-06、XW-10和XW-12，將這5株菌株接種液體茶湯發(fā)酵，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株XW-10降解茶湯中粗纖維的能力最強(qiáng)。廖東興［4］研究發(fā)現(xiàn)，粗纖維含量在渥堆發(fā)酵過程中呈下降趨勢。纖維素酶作為胞壁水解酶類，可以增加細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)多酚類物質(zhì)和游離氨基酸等的溶出，提高水浸出物的含量，有助于保障成品茶中含有豐富的水浸出物。

圖2 初篩菌株對水溶性果膠含量的影響Fig.2 Effects of different strains on water-soluble pectin content

圖3 初篩菌株對粗纖維含量的影響Fig.3 Effects of different strains on crude cellulose content

2.4 多酚氧化酶產(chǎn)生菌的篩選

多酚氧化酶是一種含銅氧化酶，在普洱茶發(fā)酵過程中，它將茶多酚氧化成茶色素類物質(zhì)，賦予普洱茶紅艷明亮、經(jīng)久耐泡的特性。筆者從固體茶葉平板上挑選出DF-03、DF-11、DF-16、DF-21、DF-28和DF-34這6株生長旺盛、褐色色素產(chǎn)量高的菌株做進(jìn)一步液體茶湯發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株DF-03降解茶多酚能力最強(qiáng)。與對照相比，茶多酚含量從26.8%下降到11.8%。楊希等［14］接種黑曲霉、米曲霉以及紅曲霉進(jìn)行普洱茶發(fā)酵，茶多酚含量分別下降 10%、12.5%和 13.5%，并且茶湯色發(fā)生明顯變化。梁名志等［15］研究人工接種對普洱茶化學(xué)成分影響發(fā)現(xiàn)，采用人工接種真菌，普洱茶中的茶多酚由生茶的28.88%下降到18.02%。多酚氧化酶可催化茶多酚氧化分解成茶色素類物質(zhì)，茶色素類物質(zhì)中含有茶多酚氧化產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、糖類和咖啡堿等物質(zhì)，成分十分復(fù)雜，而茶黃素、茶褐素和茶紅素三者的含量和比例對普洱茶的湯色和葉底又有著直接的關(guān)系［16］。因此，多酚氧化酶產(chǎn)生菌的篩選與添加對普洱茶品質(zhì)成分的形成具有重要意義。

圖4 初篩菌株對茶多酚含量的影響Fig.4 Effects of different strains on tea polyphenols content

2.5 菌株的初步鑒定

根據(jù)《真菌鑒定手冊》［17］、《酵母菌的特征與鑒定手冊》［18］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》［19］對所篩菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定。鑒定結(jié)果表明，所篩菌株絕大多數(shù)為霉菌，僅有少量酵母和細(xì)菌。其中，產(chǎn)蛋白酶菌株DB-16菌落生長較快，質(zhì)地疏松，初呈淡黃色，后轉(zhuǎn)黃褐色至淡綠褐色，背面無色，可利用多種基質(zhì)生長，初步判斷為米曲霉；產(chǎn)果膠酶菌株GJ-02菌落最初呈白色，后變?yōu)榛液稚?，菌絲匍匐爬行，無色，假根發(fā)達(dá)，分枝呈根狀，褐色，初步判斷為根霉；產(chǎn)纖維素酶菌株XW-10和產(chǎn)多酚氧化酶菌株DF-03菌落生長迅速，分生孢子頭呈放射狀，產(chǎn)酶豐富，孢子顏色分別呈褐色和黑色，初步判斷均為黑曲霉，但菌落形態(tài)（尤其是孢子顏色和數(shù)量）差異明顯，初步判斷并非同一株菌。再將DB-16、GJ-02、XW-10和DF-03的18s rDNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，利用Blastn工具進(jìn)行序列比對，對這3株菌進(jìn)行序列相似性分析。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，DB-16為米曲霉（Aspergillus oryzae），相似度98.62%；GJ-02為米根霉（Rhizopus oryzae），相似度98.57%；XW-10和DF-03均為黑曲霉（Aspergillus niger），相似度分別為 99.10%和99.92%。

2.6 微生物對普洱茶感官品質(zhì)的影響

分別挑選產(chǎn)4種酶的微生物中的優(yōu)良菌株，接種普洱茶固體發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)云南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 53/T 102-2003對四組茶葉進(jìn)行內(nèi)質(zhì)感官評審，評審結(jié)果見表2。與對照相比，蛋白酶產(chǎn)生菌DB-16明顯提升了普洱茶香氣和滋味。這是由于蛋白酶將茶葉中的蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸，而氨基酸一方面直接提高普洱茶的鮮爽度，相對降低普洱茶的苦澀味，另一方面又可分解轉(zhuǎn)化成香氣物質(zhì)，或與多酚氧化產(chǎn)物形成茶色素類物質(zhì)［5］。果膠酶產(chǎn)生菌GJ-02對普洱茶滋味的提升較大。普洱茶中原果膠在果膠酶的催化作用下水解成水溶性果膠和其他可溶性糖類，水溶性果膠是普洱茶醇厚口感的直接決定因素，可溶性糖又可降低普洱茶的苦澀味，兩者共同賦予其“濃醇甘夷”的特性［12］。纖維素酶產(chǎn)生菌XW-10對普洱茶整天感官特性都有所提升，但幅度不大。這是由于纖維素酶改變了細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)了普洱茶中可溶性糖和氨基酸等的釋放。多酚氧化酶產(chǎn)生菌DF-03對普洱茶滋味和湯色的提升較為明顯。多酚氧化酶一方面大大降低了茶多酚的含量，改善了普洱茶的滋味；另一方面，茶多酚的降解產(chǎn)物茶色素對普洱茶的湯色起著決定性的作用。茶黃素、茶紅素和茶褐素的含量和比例賦予普洱茶紅艷明亮的獨(dú)特品質(zhì)［14，16］。普洱茶的發(fā)酵是茶葉內(nèi)的物質(zhì)在各種微生物分泌的胞外酶和水熱作用下，發(fā)生降解、轉(zhuǎn)化、聚合等反應(yīng)，最終形成獨(dú)特的風(fēng)味。普洱茶自然發(fā)酵過程中，微生物種類繁多，功能各異，但并非沒有規(guī)律可循［20］。

表2 微生物對普洱茶感官品質(zhì)的影響Table 2 Effects of different functional microbes on sensory quality of Pu-erh tea

3 結(jié)論

蛋白酶產(chǎn)生菌可明顯增加液體茶湯中游離氨基酸的含量，DB-16最為明顯；果膠酶產(chǎn)生菌的接入促使液體茶湯中水溶性果膠含量明顯升高，其中接種菌株GJ-02的實(shí)驗(yàn)組較對照提升了近4倍；纖維素酶產(chǎn)生菌可分解普洱茶中粗纖維，促進(jìn)可溶性糖及其他物質(zhì)的溶出，其中XW-10效果最佳；在茶多酚降解菌株中，DF-03的能力最強(qiáng)，茶多酚含量下降了15%。蛋白酶產(chǎn)生菌DB-16明顯提升了普洱茶香氣和滋味；果膠酶產(chǎn)生菌GJ-02對普洱茶滋味的提升較大；纖維素酶產(chǎn)生菌XW-10對普洱茶整天感官特性都有所提升，但幅度不大；多酚氧化酶產(chǎn)生菌DF-03對普洱茶滋味和湯色的提升較為明顯。產(chǎn)酶微生物對普洱茶感官品質(zhì)的提升，其實(shí)質(zhì)是微生物分泌的胞外酶與普洱茶營養(yǎng)物質(zhì)之間相互作用的結(jié)果。因此，在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中，外源微生物或者酶的添加對提升普洱茶品質(zhì)和穩(wěn)定性以及縮短發(fā)酵周期具有重要意義。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Screening of functional microbes from Pu-erh tea and their effects on the sensory quality of Pu-erh tea

FENG Lingran，WANG Qiang，LUO Wei，YU Xiaobin
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The fermentation of Pu-erh tea is a series complex chemical reaction by enzymes produced by fungi to convert chemical component of sun-dried green tea leaves，to generate unique Pu-erh flavors.In this study，we isolated some functional microbes from Pu-erh tea.After molecular identification，main microbes DB-16 and GJ-02 are identified as Aspergillus oryzae and Rhizopus oryzae，respectively；DF-03 and XW-10are Aspergillus niger.Then these strains were inoculated to Pu-erh tea fermentation to study their effects on sensory quality of Pu-erh tea.The results show that Pu-erh tea's aroma is mainly connected with proteinase-producing strain with anaroma score of 31（control 28，total score 40）after inoculating DB-16；the liquor color is mainly affected by polyphenol oxidase-producing strain with a liquor color score of 19（control 12，total score 20）after inoculating DF-03.All of these strains stimulated the development of Pu-erh tea's aroma and color.

Pu-erh tea；screening；microbe；enzyme；sensory quality

TS272.5

A

1672-3678（2015）02-0093-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.018

2014-01-10

江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程（111-2-06）

馮玲然（1988—），女，河南南樂人，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)；余曉斌（聯(lián)系人），教授，E-mail：xbyu@jiangnan.edu.cn